Summary

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

Published: June 14, 2020
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Summary

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Abstract

In der Utero-Elektroporation ist eine In-vivo-DNA-Transfertechnik, die ausgiebig zur Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen verwendet wird, die der Kortikogenese von Säugetieren zugrunde liegen. Dieses Verfahren nutzt die Hirnventrikel, um die Einführung von DNA von Interesse zu ermöglichen und verwendet ein Paar Von Elektroden, um den Eingang des genetischen Materials in die Zellen zu lenken, die die Herzkammer, die neuronalen Stammzellen auskundschaften. Diese Methode ermöglicht es Forschern, die gewünschten Zellen zu kennzeichnen und/oder die Expression von Genen zu manipulieren, die für diese Zellen von Interesse sind. Es hat mehrere Anwendungen, einschließlich Assays, die auf neuronale Migration, Linienverfolgung und axonale Pfadfindung abzielen. Ein wichtiges Merkmal dieser Methode ist ihre zeitliche und regionale Kontrolle, die die Umgehung potenzieller Probleme im Zusammenhang mit embryonaler Letalität oder dem Fehlen spezifischer CRE-Treibermäuse ermöglicht. Ein weiterer relevanter Aspekt dieser Technik ist, dass sie dazu beiträgt, die wirtschaftlichen und zeitlichen Einschränkungen, die die Erzeugung neuer Mauslinien beinhalten, erheblich zu reduzieren, die besonders wichtig für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Zelltypen werden, die in entfernten Bereichen des Gehirns in unterschiedlichen Entwicklungszeiten entstehen. Hier beschreiben wir eine Doppelelektroporationsstrategie, die die Ausrichtung von Zellpopulationen ermöglicht, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Mit diesem Ansatz können wir verschiedene Subtypen von Zellen an verschiedenen Orten mit ausgewählten fluoreszierenden Proteinen kennzeichnen, um sie zu visualisieren, und/oder wir können Gene von Interesse manipulieren, die von diesen verschiedenen Zellen zu den entsprechenden Zeiten ausgedrückt werden. Diese Strategie erhöht das Potenzial der in utero Elektroporation und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Verhalten von zeitlich und räumlich getrennten Zellpopulationen zu untersuchen, die migrieren, um enge Kontakte zu knüpfen, sowie langfristige Interaktionen durch axonale Projektionen, wodurch zeitliche und wirtschaftliche Kosten reduziert werden.

Introduction

Die Großhirnrinde ist eine sehr komplexe und kompliziert organisierte Struktur. Um einen solchen Organisationsgrad zu erreichen, durchlaufen kortikale Projektionsneuronen komplexe Entwicklungsprozesse, die ihre zeitliche Generierung erfordern, die Migration zum endgültigen Bestimmungsort in der kortikalen Platte und die Etablierung von Kurz- und Langstreckenverbindungen1,2. Lange Zeit basierte die klassische Art, Die Kortikogenese zu studieren, auf der Verwendung von Knockout- oder Knock-in-Murine-Modellen von Genen von Interesse. Diese Strategie, insbesondere die Verwendung von bedingten Knockout-Mäusen, ist jedoch zeitaufwändig und teuer und wirft manchmal zusätzliche Probleme hinsichtlich der Existenz genetischer Redundanz oder des Fehlens spezifischer CRE-Treiber auf, unter anderem. Einer der Ansätze, die entstanden, um zu versuchen, diese Probleme anzugehen, und das wird heutzutage ausgiebig verwendet, um die kortikale Entwicklung zu studieren, ist in der Utero-Elektroporation3,4. In der Utero-Elektroporation ist eine Technik für die somatische Transgenese verwendet, die in vivo Targeting von neuronalen Stammzellen und ihre Nachkommen ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellen durch die Expression von fluoreszierenden Proteinen5,6, für Genmanipulation in vivo (d.h. Gewinn oder Verlust von Funktionsassays)7,8,9, zur Isolierung elektropoierter Kortiken in vitro und Kultivierungszellen8,10. Darüber hinaus ermöglicht die In-Utero-Elektroporation eine zeitliche und regionale Kontrolle des Zielgebiets. Diese Technik hat zahlreiche Anwendungen und wurde weit verbreitet, um neuronale Migration zu studieren, Stammzellteilung, neuronale Konnektivität, und andere Themen8,9,11,12.

Das aktuelle Manuskript beschreibt die Verwendung einer in utero Elektroporation Variante, die als Doppelin der Utero-Elektroporation bezeichnet wird, um die Wechselwirkungen von Zellen in der Großhirnrinde mit unterschiedlichen zeitlichen und räumlichen Ursprüngen zu analysieren. Diese Studien sind äußerst komplex, wenn sie murine Modelle verwenden, da sie die kombinierte Verwendung mehrerer transgener Linien erfordern. Einige der Anwendungen des protokolls, das in diesem Papier beschrieben wird, umfassen die Untersuchung enger Wechselwirkungen zwischen benachbarten Zellen sowie Wechselwirkungen zwischen entfernten Zellen durch weiträumige Projektionen. Die Methode erfordert die Durchführung von zwei unabhängigen in utero Elektroporation Operationen, zeitlich und räumlich getrennt, auf den gleichen Embryonen, um verschiedene Zellpopulationen von Interesse zu zielen. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit, die Genfunktion in einer oder beiden Arten von Neuronen mit Wildtieren zu manipulieren. Darüber hinaus können diese funktionellen Experimente mit der Expression von zytoplasmatischen oder membrangetaggten fluoreszierenden Proteinen kombiniert werden, um die feine Morphologie von Zielzellen, einschließlich Dendriten und Axonen, zu visualisieren und mögliche Unterschiede in zellulären Wechselwirkungen im Vergleich zu einer Kontrolle zu analysieren (d. h. Zellen, die nur mit dem fluoreszierenden Protein gekennzeichnet sind).

Das hier abgegrenzte Protokoll konzentriert sich auf die Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen innerhalb des Neocortex, aber diese Strategie könnte auch verwendet werden, um Wechselwirkungen mit extrakortikalen Bereichen zu untersuchen, die mit Hilfe der Uteroelektroporation, wie dem Subpallium oder dem Thalamus13,,14, oder Zell-Zell-Wechselwirkungen in anderen Strukturen, wie dem Kleinhirn15, gezielt betrachtet werden können. Die Ausrichtung auf verschiedene Bereiche basiert auf der Ausrichtung der Elektroden und auf dem Ventrikel, in dem die DNA injiziert wird (lateral, dritte oder vierte). Mit der hier beschriebenen Strategie können wir eine beträchtliche Anzahl von Zellen kennzeichnen, was nützlich ist, um allgemeine Veränderungen der Konnektivität/Innervation in funktionellen Experimenten zu bewerten. Dennoch, um feine Veränderungen in der Konnektivität zu untersuchen, kann man modifizierte Versionen der Utero-Elektroporation verwenden, um eine spärlichere Beschriftung zu erhalten und einzelne Zellen zu identifizieren16. Zusammenfassend ist die Doppel-Elektroporation eine vielseitige Methode, die es ermöglicht, zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzusprechen und ihre Wechselwirkungen im Detail zu untersuchen, entweder unter Kontrollbedingungen oder in Kombination mit funktionellen Experimenten, wodurch die zeitlichen und wirtschaftlichen Kosten erheblich reduziert werden.

Protocol

Das hier beschriebene Verfahren wurde von der für Experimente zuständigen Ethikkommission, den Tierschutz der Universidad de Valencia und der Conselleria de Agricultura genehmigt. Desarrollo Rural, Emergencia Climética y Transicién Ecoléngica der Comunidad Valenciana und hält sich an die Leitlinien des Internationalen Rates für Labortierkunde (ICLAS), die im Real Decreto 53/2013 der spanischen Gesetzgebung sowie in der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates überprüft wurden. <p clas…

Representative Results

Wechselwirkungen zwischen benachbarten Zellen entstanden an distalen Orten und zu verschiedenen Zeiten: Cajal-Retzius-Zellen (CR-Zellen) und früh wandernde kortikale Projektionsneuronen (Strategie A) Die Wechselwirkung von CR-Zellen und frühen kortikalen Projektionsneuronen wurde zuvor als notwendig beschrieben, um die somale Translokation über Nectin- und Cadherinadhäsionsmoleküle mit einer Doppelelektroporationsstrategie zu regulieren8. CR-Zellen…

Discussion

Die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen in vivo in Regionen mit hoher Zelldichte wie der Großhirnrinde ist eine komplexe Aufgabe. Herkömmliche Ansätze, einschließlich der Verwendung von Antikörpern zur Kennzeichnung von Neuriten, sind nicht geeignet, da es an spezifischen Markern für verschiedene Zellpopulationen fehlt. Die Verwendung von transgenen murinen Modellen, bei denen ein bestimmter Zelltyp ein fluoreszierendes Protein ausdrückt, ist nützlich, um die neuronalen Prozesse zu visualisieren, aber die…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Cristina Andrés Carbonell und Mitgliedern der Tierpflegeeinrichtung der Universidad de Valencia für die technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei Isabel Fari’as und Sacramento R. Ferron für die Reagenzien und die gemeinsame Nutzung ihrer Ausrüstung mit uns bedanken. I.M.W wird durch einen Vertrag von der Conselleria de Educacion de Valencia (GJIDI/2018/A/221) finanziert, D.dA.D wird vom Ministerio de Ciencia, Innovacién y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150) finanziert. C.Gil-Sanz hält einen Ramen y Cajal Grant (RYC-2015-19058) vom spanischen Ministerio de Ciencia, Innovacién y Universidades (MICINN). Diese Arbeit wurde RYC-2015-19058 und SAF2017-82880-R (MICINN) finanziert.

Materials

Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518-25G
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177-5EA
Baby-mixter hemostat (perfusion) Fine Science Tools (FST) 13013-14
Borosilicate glass capillary WPI 1B100-6
Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) Rb Pharmaceuticals Limited 921425
CAG-BFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-EGFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-mCherry plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
Confocal microscope Olympus FV10i
Cotton Swabs BFHCVDF
Cyanoacrylate glue B. Braun Surgical 1050044
Dissecting scope Zeiss stemi 305
Dumont Forceps #5 Fine Forceps Fine Science Tools (FST) 11254-20
ECM830 Square Wave Electroporator BTX 45-0052
Electric Razor Oster 76998
Endotoxin-free TE buffer QIAGEN 1018499
Ethanol wipes BFHCVDF
Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools (FST) 11150-10
Eye ointment Alcon 682542.6
Fast Green dye Sigma-Aldrich F7252-5G
Fine Scissors Fine Science Tools (FST) 14069-09
Fluorescence LEDs CoolLED pE-300-W
Genopure Plasmid Maxi Kit Roche 3143422001
Halsted-Mosquito Hemostats (suture) Fine Science Tools (FST) 91308-12
Heating Pad UFESA AL5514
Inverted epifluorescence microscope Nikon Eclipse TE2000-S
Iodine wipes Lorsoul
Isofluorane vaporizer Flow-Meter A15B5001
Isoflurane Karizoo 586259
Ketamine (Anastemine) Fatro Ibérica SL 583889-2
Kimtech precision wipes Kimberly-Clark 7252
LB (Lennox) Agar GEN Labkem AGLB-00P-500
LB (Lennox) broth GEN Labkem LBBR-00P-500
Low-melting point agarose Fisher Scientific BP165-25
Medetomidine (Sedator) Dechra 573749.2
Microscope coverslips Menel-Gläser 15747592
Microscope Slides Labbox SLIB-F10-050
Mounting medium Electron Microscopy Sciences 17984-25
Mutiwell plates (24) SPL Life Sciences 32024
Mutiwell plates (48) SPL Life Sciences 32048
NaCl (for saline solution) Fisher Scientific 10112640
Needle 25 G (BD Microlance 3) Becton, Dickinson and Company 300600
Orbital incubator S150 Stuart Scientific 5133
P Selecta Incubator J. P. Selecta, s.a. 0485472
Paraformaldehyde PanReac AppliedChem A3813
Penicillin-Streptomycin Sigma -Aldrich P4333
Peristaltic perfusion pump Cole-Parmer EW-07522-30
Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter Btx 45-0489
Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 AgnThos 203-1000
Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm AgnThos 204-1000
Ring Forceps Fine Science Tools (FST) 11103-09
Sodium azide PanReac AppliedChem 122712-1608
Surgical absorbent pad (steryle) HK Surgical PD-M
Suture (Surgicryl PGA 6-0) SMI Suture Materials BYD11071512
Syringe 1ml (BD plastipak) Becton, Dickinson and Company 303172
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Falcon 353003
Vertical Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-30
Vertical microscope Nikon Eclipse Ni
Vibratome Leica VT1200S

Referências

  1. Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
  2. Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
  7. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  8. Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
  9. Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
  10. Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
  11. Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
  12. Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
  13. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
  14. Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
  15. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Biologia do Desenvolvimento. 322, 345-354 (2008).
  16. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
  17. Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
  18. Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
  19. Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
  20. Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
  21. Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
  22. Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
  23. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
  24. Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
  25. Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
  26. Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
  27. Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
  28. DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
  29. Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).

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Mateos-White, I., Fabra-Beser, J., de Agustín-Durán, D., Gil-Sanz, C. Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations. J. Vis. Exp. (160), e61046, doi:10.3791/61046 (2020).

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