Двойной в утробе электропорации для целевой временно и пространственно отделенных популяций клеток
Summary
Двойная электропорация матки позволяет ориентироваться на популяции клеток, которые пространственно и временно разделены. Этот метод полезен для визуализации взаимодействий между этими популяциями клеток с использованием флуоресцентных белков в нормальных условиях, но и после функциональных экспериментов, чтобы возмутить гены, представляющие интерес.
Abstract
В утробе электропорации in vivo метод передачи ДНК широко используется для изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе кортикогенеза млекопитающих. Эта процедура использует желудочки мозга, чтобы позволить введение ДНК интерес и использует пару электродов, чтобы направить вход генетического материала в клетки, выстилающие желудочек, нервные стволовые клетки. Этот метод позволяет исследователям маркировать желаемые клетки и/или манипулировать выражением генов, представляющих интерес в этих клетках. Он имеет несколько приложений, в том числе анализы, ориентированные на миграцию нейронов, отслеживание линий и аксональный поиск путей. Важной особенностью этого метода является его временный и региональный контроль, позволяющий обойти потенциальные проблемы, связанные с эмбриональной летальностью или отсутствием конкретных мышей-водителей CRE. Другим важным аспектом этого метода является то, что он помогает значительно уменьшить экономические и временные ограничения, которые связаны с генерацией новых линий мыши, которые становятся особенно важными в изучении взаимодействий между типами клеток, которые возникают в отдаленных областях мозга в разном возрасте развития. Здесь мы описываем стратегию двойного электропорации, которая позволяет ориентироваться на популяции клеток, которые пространственно и временно разделены. При таком подходе мы можем маркировать различные подтипы клеток в разных местах с выбранными флуоресцентными белками, чтобы визуализировать их, и/или мы можем манипулировать генами, представляющими интерес, выраженными этими различными клетками в надлежащее время. Эта стратегия повышает потенциал в электропорации матки и обеспечивает мощный инструмент для изучения поведения временно и пространственно разделенных популяций клеток, которые мигрируют для установления тесных контактов, а также дальнобойных взаимодействий через аксональные прогнозы, снижая временные и экономические издержки.
Introduction
Кора головного мозга является очень сложной и замысловато организованной структурой. Для достижения такой степени организации, корковые проекционные нейроны проходят через сложные процессы развития, которые требуют их временного поколения, миграции к конечному пункту назначения в корковой пластине, и создания коротких и дальних соединений1,2. Долгое время классический способ изучения кортикогенеза основывался на использовании нокаут-или стук-в мурин модели генов, представляющих интерес. Тем не менее, эта стратегия, и в частности использование условного нокаут мышей, занимает много времени и дорого, а иногда и создает дополнительные проблемы, связанные с существованием генетической избыточности или отсутствие конкретных драйверов CRE, среди других вопросов. Один из подходов, которые возникли, чтобы попытаться решить эти проблемы, и что в настоящее время широко используется для изучения коркового развития в утробеэлектропорации 3,4. В утробе электропорации является метод, используемый для соматического трансгенеза, что позволяет in vivo ориентации нервных стволовых клеток и их потомства. Этот метод может быть использован для обозначения клеток по выражению флуоресцентных белков5,,6, для манипуляции генами in vivo (т.е. получить или потерю функциональных анализов)7,8,9, для изоляции электропорированных кортиков в пробирке и культивирования клеток8,10., Кроме того, в утробе электропорации допускается временное и региональное управление целевым районом. Этот метод имеет многочисленные применения и широко используется для изучения нейронной миграции, деления стволовых клеток, нейронной связи, и другие предметы8,9,11,12.
Нынешняя рукопись описывает использование в утробе электропорации вариант, называется двойной в утробе электропорации, для анализа взаимодействий клеток в коре головного мозга с различными височных и пространственных происхождения. Эти исследования чрезвычайно сложны для завершения при использовании моделей мурина, поскольку они требуют комбинированного использования нескольких трансгенных линий. Некоторые из применений протокола, описанного в настоящем документе, включают изучение тесных взаимодействий между соседними клетками, а также взаимодействия между удаленными клетками через долгосрочные проекции. Метод требует выполнения двух независимых в утробе электропорации операций, разделенных временно и пространственно, на одних и тех же эмбрионов для целевой различных групп клеток, представляющих интерес. Преимуществом такого подхода является возможность манипулирования функцией генов в одном или обоих типах нейронов с использованием диких животных типа. Кроме того, эти функциональные эксперименты могут быть объединены с выражением цитоплазматических или мембранных флуоресцентных белков для визуализации тонкой морфологии целевых клеток, включая дендритов и аксонов, и анализировать возможные различия в клеточных взаимодействиях по сравнению с контролем (т.е. клетки, помеченные только флуоресцентным белком).
Протокол, очерченный здесь, сосредоточен на изучении клеточных взаимодействий внутри неокортекса, но эта стратегия может также быть использована для изучения взаимодействий с внекортикальными областями, которые могут быть направлены с помощью электропорации внутриутробности, как подпаллий или таламус13,,14, или клеточно-клеточных взаимодействий в других структурах, таких как мозжечок15. Ориентация на различные области основана на ориентации электродов и на желудочке, где впрыскивается ДНК (боковая, третья или четвертая). При описанной здесь стратегии мы можем обозначить значительное количество ячеек, что полезно для оценки общих изменений в подключении/иннервации в функциональных экспериментах. Тем не менее, для изучения мелких изменений в подключении, можно использовать модифицированные версии в электропорации матки, чтобы получить разреженную маркировку и определить одиночные клетки16. Таким образом, двойное в утробе электропорации является универсальным методом, который позволяет ориентации временно и пространственно разделенных популяций клеток и изучение их взаимодействия в деталях, либо в условиях контроля или в сочетании с функциональными экспериментами, значительно снижая временные и экономические затраты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изучение клеточно-клеточных взаимодействий в виво в регионах с высокой клеточной плотностью, как кора головного мозга является сложной задачей. Традиционные подходы, включая использование антител для обозначения нейритов, не подходят из-за отсутствия специфических маркеров для разл?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Кристину Андрес Карбонелл и сотрудников центра по уходу за животными Университета Валенсии за техническую помощь. Мы также хотим поблагодарить Изабель Фариньяс и Сакраменто Р. Феррон за реагенты и обмен их оборудованием с нами. I.M.W финансируется за счет контракта Гарантии Джувениля от Консорциума де Эдуказон де Валенсия (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D финансируется Министерством де Сьенсия, Innovaci’n y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). К.Гиль-Санс имеет Рамон и Каджал Грант (RYC-2015-19058) от испанского Ministerio de Ciencia, Innovaci’n y Universidades (MICINN). Эта работа была профинансирована RYC-2015-19058 и SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Referências
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Biologia do Desenvolvimento. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
