Double In Utero Electroporation att rikta temporally och rumsligt åtskilda cell populationer
Summary
Dubbel in utero elektroporation tillåter inriktning cell populationer som är rumsligt och tidsmässigt separerade. Denna teknik är användbar för att visualisera interaktioner mellan dessa cellpopulationer med fluorescerande proteiner under normala förhållanden, men också efter funktionella experiment för att störa gener av intresse.
Abstract
In utero elektroporation är en in vivo DNA-överföring teknik som används i stor utsträckning för att studera de molekylära och cellulära mekanismer som ligger till grund för däggdjur kortikogenes. Detta förfarande drar nytta av hjärnans ventriklar för att möjliggöra införandet av DNA av intresse och använder ett par elektroder för att styra ingången av det genetiska materialet i cellerna som kantar ventrikeln, de neurala stamcellerna. Denna metod gör det möjligt för forskare att märka de önskade cellerna och/eller manipulera uttrycket av gener av intresse för dessa celler. Den har flera program, inklusive analyser som riktar sig till neuronal migration, härstamning spårning, och axonal pathfinding. Ett viktigt inslag i denna metod är dess tidsmässiga och regionala kontroll, vilket möjliggör kringgående av potentiella problem relaterade med embryonal dödlighet eller bristen på specifika CRE-drivrutinsmöss. En annan relevant aspekt av denna teknik är att det bidrar till att avsevärt minska de ekonomiska och tidsmässiga begränsningar som involverar utvecklingen av nya muslinjer, som blir särskilt viktigt i studiet av interaktioner mellan celltyper som har sitt ursprung i avlägsna områden i hjärnan vid olika utvecklingsåldrar. Här beskriver vi en dubbel elektroporation strategi som möjliggör inriktning av cell populationer som är rumsligt och tidsmässigt separerade. Med detta tillvägagångssätt kan vi märka olika subtyper av celler på olika platser med utvalda fluorescerande proteiner för att visualisera dem, och/ eller vi kan manipulera gener av intresse som uttrycks av dessa olika celler vid lämpliga tidpunkter. Denna strategi ökar potentialen hos in utero elektroporation och ger ett kraftfullt verktyg för att studera beteendet hos tidsmässigt och rumsligt separerade cellpopulationer som migrerar för att upprätta nära kontakter, samt långväga interaktioner genom axonal projektioner, minska tidsmässiga och ekonomiska kostnader.
Introduction
Hjärnbarken är en mycket komplex och invecklat organiserad struktur. För att uppnå en sådan grad av organisation, när projektion nervceller gå igenom komplexa utvecklingsprocesser som kräver deras tidsmässiga generation, migration till slutdestinationen i kortikal plattan, och inrättandet av kort-och långväga anslutningar1,2. Under lång tid var det klassiska sättet att studera kortikogenes baserat på användning av knockout eller knock-in murine modeller av gener av intresse. Denna strategi, och särskilt användningen av villkorliga knockout-möss, är dock tidskrävande och dyr, och innebär ibland ytterligare problem när det gäller förekomsten av genetisk redundans eller bristen på specifika CRE-drivrutiner, bland andra frågor. En av de metoder som uppstod för att försöka ta itu med dessa problem och som numera används i stor utsträckning för att studera när utveckling är in utero elektroporation3,4. In utero elektroporation är en teknik som används för somatisk transgenes, möjliggör in vivo inriktning av neurala stamceller och deras avkomma. Denna metod kan användas för att märka celler med uttryck av fluorescerande proteiner5,6, för genmanipulation in vivo (dvs. vinst eller förlust av funktionsanalyser)7,,8,9, för att isolera elektroporerade kortiker in vitro- och odlingsceller8,10. Dessutom tillåter in utero elektroporation tidsmässig och regional kontroll av det riktade området. Denna teknik har många tillämpningar och har använts i stor utsträckning för att studera neuronal migration, stamceller division, neuronal anslutning, och andra ämnen8,9,11,12.
Det aktuella manuskriptet beskriver användningen av en in utero elektroporation variant, kallas dubbel in utero elektroporation, att analysera interaktioner av celler i hjärnbarken med olika tidsmässiga och rumsliga ursprung. Dessa studier är extremt komplexa att slutföra när man använder murine modeller eftersom de kräver kombinerad användning av flera transgena linjer. Några av de tillämpningar av protokollet som beskrivs i detta dokument inkluderar studiet av nära interaktioner mellan angränsande celler, samt interaktioner mellan avlägsna celler genom långväga prognoser. Metoden kräver att utföra två oberoende in utero elektroporation operationer, separerade tidsmässigt och rumsligt, på samma embryon för att rikta olika cell populationer av intresse. Fördelen med detta tillvägagångssätt är möjligheten att manipulera genfunktion i en eller båda typerna av nervceller med vilda typer av djur av vild typ. Dessutom kan dessa funktionella experiment kombineras med uttrycket av cytoplasmatiska eller membranmärkta fluorescerande proteiner för att visualisera den fina morfologin hos riktade celler, inklusive dendriter och axoner, och analysera möjliga skillnader i cellulära interaktioner i jämförelse med en kontroll (dvs. celler som endast är märkta med fluorescerande protein).
Protokollet beskrivs här är inriktad på studier av cellulära interaktioner inuti neocortex, men denna strategi kan också användas för att undersöka interaktioner med extrakortikala områden som kan riktas med hjälp av utero elektroporation, som subpallium eller thalamus13,14, eller cell-cell interaktioner i andra strukturer, som lillhjärnan15. Inriktning av olika områden baseras på elektrodernas orientering och på ventrikeln där DNA injiceras (lateralt, tredje eller fjärde). Med den strategi som beskrivs här kan vi märka ett stort antal celler, vilket är användbart för att utvärdera allmänna förändringar i anslutning /innervation i funktionella experiment. Ändå, för att studera fina förändringar i anslutning, kan man använda modifierade versioner av in utero elektroporation för att få sparser märkning och identifiera enskilda celler16. Sammanfattningsvis är dubbel in utero elektroporation en mångsidig metod som gör det möjligt att rikta tidsmässigt och rumsligt åtskilda cellpopulationer och studera deras interaktioner i detalj, antingen i kontrollförhållanden eller i kombination med funktionella experiment, avsevärt minska tidsmässiga och ekonomiska kostnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiet av cell-cell interaktioner in vivo i regioner med hög cellulär densitet som hjärnbarken är en komplex uppgift. Traditionella metoder, inklusive användning av antikroppar för att märka neuriter är inte lämpliga på grund av bristen på specifika markörer för olika cellpopulationer. Användningen av transgena murinmodeller, där en viss celltyp uttrycker ett fluorescerande protein, är användbart för att visualisera de neuronala processerna, men detta beror på tillgången på sådana modeller. Denna u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Cristina Andrés Carbonell och medlemmar av Animal Care anläggningen i Universidad de Valencia för tekniskt stöd. Vi vill också tacka Isabel Fariñas och Sacramento R. Ferrón för reagenser och dela sin utrustning med oss. I.M.W finansieras genom ett Garantía Juvenil-kontrakt från Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D finansieras av Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz innehar ett Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) från den spanska ministernio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Detta arbete finansierades RYC-2015-19058 och SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Referências
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Biologia do Desenvolvimento. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
