Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift
Summary
Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.
Abstract
Rahim elektroporasyonunda, memeli kortikogenezinin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için yaygın olarak kullanılan in vivo DNA transfer tekniğidir. Bu prosedür ilgi DNA giriş sağlamak için beyin ventrikülleri yararlanır ve venörl astar hücrelere genetik malzemenin girişini yönlendirmek için elektrotlar bir çift kullanır, nöral kök hücreleri. Bu yöntem, araştırmacıların istenilen hücreleri etiketlemelerine ve/veya bu hücrelerdeki ilgi genlerinin ekspresyonunu manipüle etmesine olanak tanır. Nöronal göçü, soy takibini ve aksonal yol bulmayı hedefleyen tahliller de dahil olmak üzere birden fazla uygulaması vardır. Bu yöntemin önemli bir özelliği, embriyonik öldürücülük veya belirli CRE sürücü farelerin eksikliği ile ilgili potansiyel sorunların circumvention sağlayan, onun zamansal ve bölgesel kontrol. Bu tekniğin bir diğer ilgili yönü de, farklı gelişimsel yaşlarda beynin uzak bölgelerinde ortaya çıkan hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin incelenmesinde özellikle önemli hale gelen yeni fare hatlarının oluşumunu içeren ekonomik ve zamansal sınırlamaların önemli ölçüde azaltılmasına yardımcı olmasıdır. Burada, mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonlarının hedeflemesini sağlayan çift elektroporasyon stratejisini açıklıyoruz. Bu yaklaşımla farklı konumlardaki farklı hücre alt tiplerini, onları görselleştirmek için seçili floresan proteinlerle etiketleyebilir ve/veya bu farklı hücrelerin ifade ettiği ilgi genlerini uygun zamanlarda manipüle edebiliriz. Bu strateji rahim elektroporasyon potansiyelini artırır ve yakın temas kurmak için göç zamansal ve mekansal olarak ayrılmış hücre popülasyonlarının davranışını incelemek için güçlü bir araç sağlar, yanı sıra aksonal projeksiyonlar yoluyla uzun menzilli etkileşimler, zamansal ve ekonomik maliyetleri azaltarak.
Introduction
Serebral korteks çok karmaşık ve karmaşık organize bir yapıdır. Organizasyon böyle bir dereceye ulaşmak için, kortikal projeksiyon nöronlar kendi zamansal nesil gerektiren karmaşık gelişimsel süreçler geçmesi, kortikal plaka nihai hedefe göç, ve kısa ve uzun menzilli bağlantıların kurulması1,2. Uzun bir süre, kortikogenez çalışma için klasik yol ilgi genlerin nakavt veya knock-in murine modellerinin kullanımına dayanıyordu. Ancak, bu strateji, ve özellikle koşullu nakavt farelerin kullanımı, zaman alıcı ve pahalı, ve bazen diğer konular arasında, genetik fazlalık veya belirli CRE sürücülerin eksikliği varlığı ile ilgili ek sorunlar sunuyor. Bu sorunları çözmek için ortaya çıkan yaklaşımlardan biri ve günümüzde yaygın kortikal gelişim çalışması için kullanılan rahim elektroporasyon3,4. Rahim elektroporasyonunda somatik transgenez için kullanılan bir tekniktir, nöral kök hücrelerin ve bunların soyundan in vivo hedefleme sağlayan. Bu yöntem floresan proteinlerin ekspresyonu ile hücreleri etiketlemek için kullanılabilir5,6, in vivo gen manipülasyonu için (yani, kazanç veya fonksiyon tahlilkaybı)7,8,9, in vitro elektroporated korteksizole ve culturing hücreleri8için,10. Ayrıca, rahim elektroporasyon hedeflenen alanın zamansal ve bölgesel kontrol sağlar. Bu teknik çok sayıda uygulama vardır ve yaygın nöronal göç, kök hücre bölünmesi, nöronal bağlantı ve diğer konular8,9,,11,12çalışma için kullanılmıştır.
Mevcut el yazması, farklı zamansal ve uzamsal kökenleri ile serebral korteks hücrelerin etkileşimlerini analiz etmek için, rahim elektroporasyon çift olarak adlandırılan bir utero elektroporasyon varyantı kullanımını açıklar. Bu çalışmalar, birkaç transgenik hattın kombine kullanımını gerektirdiğinden, mindik modellerini kullanırken tamamlamak son derece karmaşıktır. Bu makalede açıklanan protokolün uygulamalarından bazıları komşu hücreler arasındaki yakın etkileşimlerin yanı sıra uzun menzilli projeksiyonlar aracılığıyla uzak hücreler arasındaki etkileşimleri incelemeyi içerir. Bu yöntem, farklı hücre popülasyonlarını hedeflemek için aynı embriyolar üzerinde zamansal ve mekansal olarak ayrılmış iki bağımsız rahim elektroporasyon ameliyatlarında performans gerektirir. Bu yaklaşımın avantajı vahşi tip hayvanları kullanarak bir veya her iki nöron türünde gen fonksiyonunu manipüle etme olasılığıdır. Buna ek olarak, bu fonksiyonel deneyler dendritler ve aksonlar da dahil olmak üzere hedeflenen hücrelerin ince morfolojisini görselleştirmek ve bir kontrolle karşılaştırıldığında hücresel etkileşimlerde olası farklılıkları analiz etmek için sitoplazmik veya membran etiketli floresan proteinlerin ekspresyonu ile kombine edilebilir (örn. sadece floresan proteinle etiketlenmiş hücreler).
Protokol burada neokorteks içinde hücresel etkileşimlerin çalışma odaklanmıştır, ama bu strateji de rahim elektroporasyon kullanılarak hedeflenebilir ekstrakortikal alanlar ile etkileşimleri incelemek için kullanılabilir, subpallium veya talamus gibi13,14, veya diğer yapılarda hücre hücre etkileşimleri, beyincik gibi15. Farklı alanların hedefedilmesi elektrotların yönelimine ve DNA’nın enjekte edildiği ventriküle (lateral, üçüncü veya dördüncü) bağlıdır. Burada açıklanan strateji ile, işlevsel deneylerde bağlanabilirlik/innervasyondaki genel değişiklikleri değerlendirmek için yararlı olan önemli sayıda hücreyi etiketleyebiliriz. Yine de, bağlantı ince değişiklikleri incelemek için, bir seyrek etiketleme almak ve tek hücreleri tanımlamak için rahim elektroporasyon değiştirilmiş sürümlerini kullanabilirsiniz16. Özetle, rahim elektroporasyonunda çift zamansal ve mekansal olarak ayrılmış hücre popülasyonlarının hedefleştirilmesine ve kontrol koşullarında ya da fonksiyonel deneylerle birlikte etkileşimlerinin ayrıntılı olarak incelenmesine olanak tanıyan çok yönlü bir yöntemdir, zamansal ve ekonomik maliyetleri önemli ölçüde azaltır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Serebral korteks gibi yüksek hücresel yoğunluğa sahip bölgelerde in vivo hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesi karmaşık bir iştir. Nöritleri etiketlemek için antikor kullanımını içeren geleneksel yaklaşımlar, farklı hücre popülasyonları için özel belirteçlerin olmaması nedeniyle uygun değildir. Belirli bir hücre tipinin floresan proteini ifade ettiği transgenik murine modellerinin kullanımı, nöronal süreçleri görselleştirmek için yararlıdır, ancak bu tür modellerin kullanılabi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Cristina Andrés Carbonell ve Universidad de Valencia Hayvan Bakım tesisi üyeleri teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Isabel Fariñas ve Sacramento R. Ferrón’a reaktifler ve ekipmanlarının bizimle paylaşılması için teşekkür etmek istiyoruz. I.M.W, Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D tarafından ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150) tarafından finanse edilmektedir. C.Gil-Sanz, İspanya Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades’ten (MICINN) Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) aldı. Bu çalışma RYC-2015-19058 ve SAF2017-82880-R (MICINN) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Referências
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Biologia do Desenvolvimento. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
