O objetivo deste protocolo é quantificar a ligação do norovírus humano eucaiótico às bactérias. Após a realização de um teste inicial de fixação vírus-bactéria, a citometria de fluxo é usada para detectar bactérias viralmente ligadas à população.
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Artigo de método
Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
As bactérias commensal são bem estabelecidas para impactar a infecção de vírus eucaióticos. A ligação direta entre o patógeno e o microbioma hospedeiro é responsável por alterar a infecção para muitos desses vírus. Assim, caracterizar a natureza da ligação vírus-bactérias é um passo fundamental necessário para elucidar os mecanismos pelos quais as bactérias alteram a infecção viral. Para norovírus humano, bactérias commensal aumentam a infecção celular B. O vírus se liga diretamente a essas bactérias, indicando que essa interação direta está envolvida no mecanismo de aumento da infecção. Uma variedade de técnicas pode ser usada para quantificar interações entre bactérias e vírus, incluindo a contagem de cintilação de vírus rotulados por radiorótulos e reação em cadeia de polimerase (PCR). Ambos os métodos requerem o uso de vírus vivo, que pode precisar ser gerado em laboratório. Atualmente, nenhum dos sistemas de cultura in vitro estabelecidos disponíveis para norovírus humano são robustos o suficiente para permitir a geração de estoques virais altamente concentrados. Em vez de vírus vivos, partículas semelhantes a vírus (VLPs) têm sido usadas para caracterizar as interações entre norovírus e bactérias. Aqui, um método de citometria de fluxo é descrito com o uso de anticorpos específicos do vírus para quantificar a ligação VIP a bactérias gram-negativas e gram-positivas. A inclusão de controles apenas de bactérias e isótipo permitiu a otimização do ensaio para reduzir a ligação de anticorpos de fundo e a quantificação precisa do apego VIP às bactérias testadas. Altas relações de VLP:bactérias resultam em VLPs vinculando-se a grandes percentuais da população bacteriana. No entanto, quando as quantidades de VIP são diminuídas, o percentual de bactérias ligadas também diminui. Em última análise, esse método pode ser empregado em experimentos futuros elucidando as condições específicas e componentes estruturais que regulam o norovírus: interações bacterianas.
Introdução
Os norovírus humanos (HuNoVs) são a principal causa de doenças gastrintestinais em todo o mundo, responsáveis por 685 milhões de infecções e mais de 200.000 mortes a cada ano1. Assim como outros vírus entéricos, a presença de bactérias commensal tem sido demonstrada para aumentar a infecção deste patógeno, bem como seu vírus substituto, murine norovirus2,3. Há também relatos conflitantes de que as bactérias podem inibir a infecção por norovírus humano4,5,6. Para vários vírus, a interação direta....
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Protocolo
NOTA: As condições de crescimento bacteriano descritas no protocolo são condições de cultura padrão para Enterobacter cloacae e Lactobacillus gasseri. Para realizar o ensaio de apego de bactérias com outras espécies bacterianas, as bactérias escolhidas devem ser cultivadas em condições padrão adequadas para a bactéria.
1. Preparando o meio de crescimento bacteriano
-
Enterobacter cloacae mídia de crescimento
- Preparar o meio líquido dissolvendo 10 g de tripptone, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio (NaCl) em 1 L de água desionizada (DI) (ver Tabela de Materiais). ....
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Resultados
As estratégias de gating utilizadas para quantificar a ligação do norovírus humano à bactéria commensal são mostradas na Figura 1. O ponto de densidade representativa fornece uma visão geral de como as amostras foram fechadas para eliminar detritos celulares e aglomerados celulares para que o anexo VIP fosse determinado em populações únicas(Figura 1A). Histogramas representativos demonstram baixos níveis de sinal.......
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Discussão
A capacidade de quantificar a ligação de vírus entéricos às bactérias é um primeiro passo crítico para elucidar os mecanismos pelos quais essas bactérias alteram a infecção viral. Os métodos descritos aqui foram otimizados para medir as interações do norovírus humano COM e. cloacae (bactéria gram-negativa) e L. gasseri (uma bactéria gram-positiva), mas podem ser adaptados para uso com qualquer vírus mamífero e bactéria de interesse. Embora os VIPs sejam uma alternativa i.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Sutonuka Bhar e Chanel Mosby-Haundrup por sua revisão crítica do manuscrito escrito, bem como A favor de Alfonso Carrillo pela assistência na geração de curvas padrão bacterianas. Este trabalho é financiado em parte por uma bolsa do Instituto Nacional de Saúde (R21AI140012) e por uma bolsa semente da Universidade da Flórida, Instituto de Ciências Alimentares e Agrícolas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de fundo redondo de polistreno de 5 ml com tampa de filtro de célula | Corning | 352235 | Após a coloração do anticorpo, a amostra é transferida para tubos para análise de citometria de fluxo. |
| Ágar | Sigma | A7002 | Usado para preparação de meios |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Pacote de gás anaeróbico usado para cultura de Lactobacillus gasseri |
| Software | |||
| BD LSR Citômetro | |||
| Albumina de soro bovino Fisher | Biorreagentes | BP1605 | Usado para citometria de fluxo |
| Tampão de Mancha de Citometria de Fluxo (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Usado para citometria de fluxo |
| Controle de Isotipo IgG2b kappa de Camundongo (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Controle de Isotipo. Este anticorpo é adquirido na forma conjugada do fabricante. |
| MRS Pó | BD Biosciences | 288130 | Usado para preparação de meios e cultura de Lactobacillus gasseri. |
| Anticorpo monoclonal G2 do capsídeo de norovírus (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Anticorpo de norovírus GII. Este anticorpo está disponível apenas na forma não conjugada e, portanto, deve ser conjugado com fluorescência antes do uso nos ensaios de citometria de fluxo descritos. Neste protocolo, o PE foi o fluor escolhido, no entanto, outras moléculas fluorescentes podem ser escolhidas como melhor se adequam ao citômetro de fluxo que está sendo utilizado pelo pesquisador. |
| Norovírus GII.4 VLP | Bioestrutura Criativa | CBS-V700 | vírus norovírus humano como partícula, VLPs foram gerados usando o sistema baculovírus e ressuspensos em solução salina tamponada com fosfato com 10% de glicerol. Os autores realizaram uma análise independente de rastreamento nanosight para determinar a concentração de partículas dos VLPs. A concentração é de aproximadamente 1011 VLPs por mililitro. Com base na concentração de proteína das VLPs, aproximadamente 200 partículas são adicionadas por bactéria em ensaios de fixação de VLP. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Diluir para 1X antes de usar. |
| Kit de rotulagem de anticorpos SiteClick R-PE | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Kit de conjugação usado para rotular anticorpos não conjugados. |
| Cloreto de sódio | Fisher Scientific | S271 | Usado para preparação de meios |
| Triptona | Oxóide | LP0042 | Usado para preparação de meios |
| Revólver de tubo | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Usado em vírus: ensaio de fixação de bactérias. Defina para a velocidade máxima (40 rpm). |
| Extrato de levedura | BD Biosciences | 212750 | Usado para preparação de meios |
Referências
- Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norov....
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Reimpressões e permissões
