Lanthipeptid synthetases katalyserar multistepreaktioner under biosyntesen av peptid naturliga produkter. Här beskriver vi ett kontinuerligt, bottom-up, väte-deuterium utbyte masspektrometri (HDX-MS) arbetsflöde som kan användas för att studera konformationsdynamiken hos lanthipeptid synthetases, liksom andra liknande enzymer som är involverade i peptid naturliga produkt biosyntes.
Väte-deuterium utbyte masspektrometri (HDX-MS) är en kraftfull metod för biofysisk karakterisering av enzym conformational förändringar och enzym-substrat interaktioner. Bland dess många fördelar konsumerar HDX-MS endast små mängder material, kan utföras under nära inhemska förhållanden utan behov av enzym / substratmärkning och kan ge rumsligt löst information om enzymkonformationsdynamik−även för stora enzymer och multiproteinkomplex. Metoden initieras genom utspädning av enzymet av intresse till buffert beredd i D2O. Detta utlöser utbytet av protium i peptidbindning mitt i (N-H) med deuterium (N-D). Vid önskade utbytespunkter släcks reaktions alikvoter, enzymet proteolyseras i peptider, peptiderna separeras av ultraprestanda flytande kromatografi (UPLC) och förändringen i massan av varje peptid (på grund av utbyte av väte mot deuterium) registreras av MS. Mängden deuteriumupptag vid varje peptid är starkt beroende av den lokala vätebindningsmiljön för den peptiden. Peptider som förekommer i mycket dynamiska regioner i enzymutbytesdeuterium mycket snabbt, medan peptider som härrör från välbeställda regioner utbytes mycket långsammare. På detta sätt rapporterar HDX-hastigheten om lokal enzymkonformationsdynamik. Perturbations till deuteriumupptag jämnar i närvaroen av olika ligands kan därefter användas för att kartlägga ligand bindningplatser, identifiera allosteric knyter kontakt, och att förstå rollen av conformational dynamik i enzym fungerar. Här illustrerar vi hur vi har använt HDX-MS för att bättre förstå biosyntesen av en typ av peptid naturliga produkter som kallas lanthipeptider. Lanthipeptider är genetiskt kodade peptider som efter translationellt modifieras av stora, multifunktionella, konformationellt dynamiska enzymer som är svåra att studera med traditionella strukturbiologiska metoder. HDX-MS ger en idealisk och anpassningsbar plattform för att undersöka de mekanistiska egenskaperna hos dessa typer av enzymer.
Proteiner är strukturellt dynamiska molekyler som provar olika konformationer på tidsskalor som sträcker sig från femtosekrerade bindningsvibrationer till omorganiseringar av hela proteindomäner som kan uppstå under många sekunder1. Dessa conformational fluktuationer är ofta kritiska aspekter av enzym/protein funktion. Till exempel är konformationsförändringar som induceras av ligandbindning ofta kritiskt viktiga för att modulera enzymfunktionen, antingen genom att organisera aktiva rester som behövs för katalys, definiera substratbindningsplatser i sekventiella kinetiska mekanismer, skydda reaktiva intermediärer från miljön eller genom att modulera enzymfunktionen via allosteriska nätverk. Nyligen genomförda studier har också visat att konformationsdynamik kan bevaras genom hela evolutionen och att förändringar i bevarade molekylära rörelser kan korreleras med förändringar i substratspecifikitet och uppkomsten av nya enzymfunktioner2,3.
Under de senaste åren har vätedeuteriumutbyte masspektrometri (HDX-MS) snabbt dykt upp som en kraftfull teknik för att undersöka hur proteinkonformationslandskap reagerar på stör som ligandbindning eller mutagena4,5,6,7. I ett typiskt HDX-MS-experiment (figur 1) placeras ett protein av intresse i en buffert som bereds i D2O, vilket utlöser ersättning av lösningsmedelsbytbara protoner med deuteria. Utbyteskursen för peptidbindningarna mitt i peptidbindningarna beror starkt på pH, den lokala aminosyrasekvensen och på den lokala strukturella miljön iamidet 8. Amides som är engagerade i vätebindningsinteraktioner (som de som finns i α-helices och β-ark) utbyter långsammare än mitt i ostrukturerade områden av proteinet som utsätts för bulklösningsmedel. Således är omfattningen av deuteriumupptag en återspegling av enzymets struktur. Enzymer som är konformationellt dynamiska, eller som genomgår strukturella övergångar på ligandbindning, förväntas ge ett mätbart HDX-svar.
Den mekanistiska grunden för den långsamma växelkursen för ett strukturerat amid visas i figur 25,8,9. För att genomgå HDX måste den strukturerade regionen först tillfälligt ta prov på en utfälld konformation, så att lösningsmedelsmolekylerna som katalyserar HDX-utbyte via en specifik syra/baskemisk mekanism har tillgång till det utbytbara amidet. I slutändan bestämmer de relativa magnituderna för den kemiskaväxelkursen (kchem)och viknings- och omviktningshastigheterna(köppna och knära)den HDX-kurs som mäts iexperimentet 5,8. Från denna enkla kinetiska modell är det uppenbart att omfattningen av deuteriumupptaget kommer att återspegla den underliggande konformationsdynamiken (enligt definitionen av köppen och knära). De flesta HDX-MS-experiment utförs i ett bottom-up arbetsflöde där, efter utbytesreaktionen, proteinet av intresse smälts in i peptider och deuteriumupptaget av varje peptid mäts som en ökning av massa7. På detta sätt tillåter HDX-MS att perturbationer till enzymkonformationsdynamik kartläggs på den lokala rumsliga skalan av peptider, vilket gör det möjligt för forskaren att bedöma hur stören förändrar dynamiken i olika regioner av enzymet av intresse.
Fördelarna med HDX-MS-metoden för att belysa proteinstrukturdynamiken är många. För det första kan metoden utföras med små mängder inhemskt protein eller på proteinkomplex i system med kvartärstruktur10. Det är inte ens nödvändigt att enzympreparatet som används i analysen är mycketrenat 11,12, så länge det nedifrån och upp HDX-MS-arbetsflödet ger ett tillräckligt antal säkert identifierade peptider som täcker proteinsekvensen av intresse. Dessutom kan HDX-MS ge information om konformationsdynamik under nästan inhemska förhållanden utan behov av platsspecifik proteinmärkning som skulle användas i fluorescensstudiermed en molekyl 13, och det finns ingen storleksgräns för proteinet eller proteinkomplexet som kan undersökas (vilket gör tillvägagångssätt som kärnmagnetisk resonans [NMR] spektroskopi utmanande)7,14. Slutligen kan tidsbefriade HDX-MS-metoder användas för att studera inneboende oordnade proteiner, som är svåra att studera med röntgenkristallografi15,16,17,18. Den huvudsakliga begränsningen av HDX-MS är att data är av låg strukturell upplösning. HDX-MS-data är användbara för att peka på var konformationsdynamiken förändras och för att avslöja kopplade konformationsförändringar, men de ger inte ofta mycket insikt i den exakta molekylära mekanismen som driver den observerade förändringen. De senaste framstegen i kombinationen av elektronfångstdisociationsmetoder med protein HDX-MS-data har visat löfte om att kartlägga utbytesplatser till enskilda aminosyrarester19, men uppföljning av biokemiska och strukturella studier behövs fortfarande ofta för att ge klarhet till strukturella modeller som vidarebefordras av HDX-MS-data.
Nedan presenteras ett detaljerat protokoll för utveckling av en HDX-MS-analys20. De provberedningsprotokoll som presenteras nedan bör i allmänhet tillämpas på alla proteiner som uppvisar god löslighet i vattenhaltiga buffertar. Mer specialiserade provberedningsmetoder och HDX-MS-arbetsflöden finns tillgängliga för proteiner än vad som behöver analyseras i närvaro av tvättmedel eller fosfolipider21,22,23,24. Instrumentella inställningar för HDX-MS datainsamling beskrivs för en högupplöst fyrdubbel flygtidsmasspektrometer i kombination med flytande kromatografisystem. Data om liknande komplexitet och upplösning kan samlas in på något av ett antal kommersiellt tillgängliga vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) system. Viktiga aspekter av databehandlingen med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt programvarupaket tillhandahålls också. Vi presenterar också riktlinjer för datainsamling och analys som överensstämmer med rekommendationerna från den bredare HDX-MS-communityn12. Det beskrivna protokollet används för att studera de dynamiska strukturella egenskaperna hos HalM2, en lanthipeptidsyntetas som katalyserar multistepsmognaden hos en antimikrobiell peptid naturlig produkt20. Vi illustrerar hur HDX-MS kan användas för att avslöja substratbindningsplatser och allosteriska egenskaper som har gäckat tidigare karakterisering. Flera andra protokoll om protein HDX-MS har publicerats under de senaste åren25,26. Tillsammans med det nuvarande arbetet bör dessa tidigare bidrag ge läsaren viss flexibilitet i experimentell design.
HDX-MS-arbetsflödet som presenteras i detta protokoll ger en anmärkningsvärt robust plattform för kartläggning av rumslig fördelning av strukturellt dynamiska element i proteiner och för att undersöka hur dessa dynamik förändras som svar på stör (ligandbindning, enzym mutagenes, etc.). HDX-MS har flera tydliga fördelar jämfört med andra strukturella biologimetoder som ofta används för att undersöka konformationsdynamik. Framför allt behövs endast små mängder protein. Med hjälp av arbetsflödet som …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, Canadian Foundation for Innovation och McGill University start-up fonder.
Reagents | |||
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
ATP | SIGMA | a2383-5G | |
D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
formic acid | Thermo Fisher | 28905 | |
guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Magnesium chloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
Potassium chloride | BioBasic | PB0440 | |
potassium phosphate | BioBasic | PB0445 | |
TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide was synthesized upon request |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
software | |||
Deuteros | Andy M C Lau, et al | version 1.08 | |
DynamX | Waters | version 3.0 | |
MassLynx | Waters | version 4.1 | |
Protein Lynx Global Server (PLGS) |
Waters | version 3.0.3 | |
PyMOL | Schrödinger | version 2.2.2 | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Instrument and equipment | |||
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column | Waters | 186002346 | |
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
HDX Manager | Waters | ||
microtip pH electrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
Waters Synapt G2-Si | Waters |