Vi beskriver en protokol for en tre-dimensionel co-kultur model af inficerede luftveje, ved hjælp af CFBE41o– celler, THP-1 makrofager, og Pseudomonas aeruginosa, etableret på luft-væske interface. Denne model giver en ny platform til samtidig at teste antibiotika effekt, epitelbarriere funktion, og inflammatoriske markører.
fDrug forskning til behandling af lungeinfektioner skrider frem i retning af prædiktive in vitro modeller af høj kompleksitet. Den mangesidede tilstedeværelse af bakterier i lungemodeller kan re-tilpasse epitel arrangement, mens immunceller koordinere en inflammatorisk reaktion mod bakterier i mikromiljø. Mens in vivo modeller har været valget til at teste nye anti-infektiøse i forbindelse med cystisk fibrose, de stadig ikke præcist efterligne in vivo betingelser for sådanne sygdomme hos mennesker og behandlingsresultater. Komplekse in vitro-modeller af de inficerede luftveje baseret på humane celler (bronkiale epitel og makrofager) og relevante patogener kunne bygge bro over dette hul og lette oversættelsen af nye anti-infektiøs i klinikken. Til sådanne formål, en co-kultur model af den menneskelige cystisk fibrose bronkiale epitelcelle linje CFBE41o– og THP-1 monocyt-afledte makrofager er blevet etableret, efterligne en infektion af den menneskelige bronkiale slimhinde ved P. aeruginosa på luft-væske interface (ALI) betingelser. Denne model er sat op i syv dage, og følgende parametre er samtidig vurderet: epitelbarriere integritet, makrofag transmigration, bakteriel overlevelse, og inflammation. Denne protokol beskriver et robust og reproducerbart system til evaluering af lægemiddeleffektivitet og værtsresponser, der kan være relevante for at opdage nye anti-infektiøsstoffer og optimere deres aerosollevering til lungerne.
Pseudomonas aeruginosa er et relevant patogen i cystisk fibrose (CF), der bidrager til nedsat lungevæv1. Produktionen af polysaccharider, såsom alginat og andre mucoid exopolysaccharider, koordinerer udviklingen af sygdommen, hvilket fører til ihærdig bakteriel overholdelse, begrænser leveringen af antibiotika til bakterier og beskytter bakterier mod værtens immunsystem2. Overgangen af P. aeruginosa fra planktonstadiet til biofilmdannelse er et kritisk spørgsmål i denne sammenhæng, hvilket også letter forekomsten af antibiotikatolerance.
I forbindelse med CF er musen primært blevet brugt som model. Mus, dog, ikke spontant udvikle denne sygdom med indførelsen af CF mutationer3. De fleste af de bakterielle biofilm udvikling og narkotika modtagelighed undersøgelser er blevet udført på abiotiske overflader, såsom petriskåle. Denne fremgangsmåde repræsenterer imidlertid ikke kompleksiteten. For eksempel er vigtige biologiske barrierer fraværende, herunder immunceller samt slimhindepitel. Selvom P. aeruginosa er ganske giftigt for epitelceller, har nogle grupper formået at co-dyrke en tidligere P. aeruginosa biofilm med menneskelige bronkiale celler. Disse celler stammer fra patienter med cystisk fibrose med CFTR-mutation (CFBE41o– celler)4 og fik lov til at vurdere antibiotiskeffekt 5 eller vurdere korrektionen af CFTR-proteinet underinfektion 6. En sådan model viste sig at forbedre forudsigeligheden af lægemidlets effektivitet, ud over at muliggøre karakterisering af problemer med lægemidler, der mislykkedes i senere faser af udviklingen af lægemidler7.
Men i lungerne, slimhinde epitel er udsat for luft. Desuden spiller immunceller, der findes i luftvejene, ligesom vævsmakrofager, en afgørende rolle mod inhalerede patogener eller partikler8. Makrofager migrere gennem de forskellige cellelag for at nå bronkial lumen og bekæmpe infektionen. Desuden, inhalerede lægemidler også nødt til at klare tilstedeværelsen af slim som en yderligere ikke-cellulære element i lungeluftblod barriere9. Faktisk er der udviklet flere komplekse tredimensionale in vitro-modeller med det formål at øge in vivo-relevansen. Co-kultur systemer ikke kun øge kompleksiteten af in vitro-systemer til opdagelse af lægemidler, men også gøre det muligt at studere celle-celle interaktioner. En sådan kompleksitet er blevet behandlet i undersøgelser om makrofag migration10, frigivelse af antimikrobielle peptider af neutrofiler11, den rolle, slimi infektion 9, og epitelcellereaktion på overdreven skade12. Men en pålidelig CF-inficeret in vitro-model, der er udstyret med den genetiske mutation i CF, der er udsat for luften (øget fysiologisk tilstand), og integrerer immunceller mangler stadig.
For at bygge bro over denne kløft beskriver vi en protokol for stabile menneskelige 3D-samkulturer i de inficerede luftveje. Modellen består af humane CF bronkiale epitelceller og makrofager, inficeret med P. aeruginosa og i stand til at repræsentere både en diffusional og immunologisk barriere. Med det mål at teste anti-infektiøs på rimeligt høj gennemløb, blev denne co-kultur etableret på den gennemtrængelige filtermembran af godt plade skær, ved hjælp af to menneskelige cellelinjer: CFBE41o– og THP-1 monocyt-afledte makrofager. Desuden, til sidst at studere deposition af aerosoliserede anti-infektiøs13, modellen blev etableret på luft-væske interface (ALI) snarere end flydende dækket betingelser (LCC).
Som vi rapporterer her, denne model giver mulighed for at vurdere ikke kun bakteriel overlevelse på en antibiotikabehandling, men også celle cytotoksicitet, epitelbarriere integritet, makrofag transmigration, og inflammatoriske reaktioner, som er væsentlige parametre for udviklingen af lægemidler.
Denne protokol kombinerer to relevante celletyper til inhalationsbehandling af lungeluftvejene: makrofager og CF bronkial epitel. Disse celler er seedet på modsatte sider af gennemtrængelige støtte skær, så celle eksponering for luft (kaldet luft-væske interface (ALI) betingelser). Denne samkultur af værtsceller er efterfølgende inficeret med P. aeruginosa. Begge værtscellelinjer er af menneskelig oprindelse: Epitelcellerne repræsenterer cystisk fibrose bronkial epitel, med en mutation på CF-kanalen (CFBE41o–), og THP-114 celler er en vel karakteriseret makrofag-lignende cellelinje. Et sammenløb epitellag er først tilladt at danne på oversiden af godt plade skær før makrofag-lignende celler er føjet til det modsatte rum. Når co-kulturen er etableret på ALI, er systemet podet med P. aeruginosa på den apikale side. Dette inficerede samkultursystem anvendes derefter til at vurdere effekten af et antibiotikum, f.eks. Følgende endepunkter analyseres: epitelbarriereintegritet i form af transepithelial elektrisk modstand (TEER), visualisering af cellecelle- og cellebakterier ved konfokal laserscanningmikroskopi (CLSM), bakteriel overlevelse ved optælling af kolonidannende enheder (CFU), værtscelleoverlevelse (cytotoksicitet) og cytokinfrigivelse.
Dette papir beskriver en protokol for en 3D co-kultur af de inficerede luftveje, der udgøres af den menneskelige cystisk fibrose bronkial epitelcellelinje CFBE41o- og den menneskelige monocyt-afledte makrofag cellelinje THP-1. Protokollen gør det muligt at vurdere epitelbarriere integritet, makrofag transmigration, bakterier overlevelse, og betændelse, som er vigtige parametre, når test af lægemidlets effektivitet og vært-respons samtidig. Det nye i modellen ligger i inkorporering af epitelceller (dvs. human CF cel…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde modtog støtte fra DEN Europæiske Unions HORIZON 2020-program for forskning, teknologisk udvikling og demonstration i henhold til tilskudsaftale nr. Vi takker Dr. Ana Costa og Dr. Jenny Juntke for den store støtte til udviklingen af co-kultur, Olga Hartwig, for den videnskabelige illustration, Anja Honecker, for ELISA assays, Petra König, Jana Westhues og Dr. Chiara De Rossi for støtte til cellekultur, analyse og mikroskopi. Vi takker også Chelsea Thorn for korrekturlæsning af vores manuskript.
Accutase | Accutase | AT104 | |
Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | – | |
CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
CFBE41o– cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
Petri dishes | Greiner | 664102 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |