Isolamento, Transfecção e Cultura de Longo Prazo de Cardiomiócitos de Ratos Adultos e Ratos
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, transfecção e cultura de longo prazo de cardiomiócitos adultos de camundongos e ratos.
Abstract
A cultura ex vivo dos cardiomiócitos mamíferos adultos (CMs) apresenta o sistema experimental mais relevante para o estudo in vitro da biologia cardíaca. Os CMs de mamíferos adultos são células terminais diferenciadas com capacidade proliferativa mínima. O estado pós-mitótico dos CMs adultos não só restringe a progressão do ciclo celular cardiomiócito, mas também limita a cultura eficiente dos CMs. Além disso, a cultura de longo prazo dos CMs adultos é necessária para muitos estudos, como a proliferação de CM e a análise da expressão genética.
O rato e o rato são os dois animais de laboratório mais preferidos para serem usados para o isolamento cardiomiócito. Embora a cultura de longo prazo dos CMs de ratos seja possível, os CMs de camundongos adultos são suscetíveis à morte e não podem ser cultivados por mais de cinco dias em condições normais. Portanto, há uma necessidade crítica de otimizar o isolamento celular e o protocolo de cultura de longo prazo para CMs murine adultos. Com este protocolo modificado, é possível isolar e cultivar com sucesso tanto os CMs de ratos adultos quanto os de ratos por mais de 20 dias. Além disso, a eficiência de transfecção do SIRNA de CM isolado é significativamente aumentada em relação aos relatórios anteriores. Para o isolamento cm do rato adulto, o método de perfusão langendorff é utilizado com uma solução enzimática ideal e tempo suficiente para dissociação completa da matriz extracelular. Para obter CMs ventriculares puros, ambos os átrios foram dissecados e descartados antes de prosseguir com a dissociação e o revestimento. As células foram dispersadas em uma placa revestida de laminina, o que permitiu uma fixação eficiente e rápida. Os CMs foram autorizados a se contentar com 4-6 h antes da transfecção do siRNA. A mídia cultural foi atualizada a cada 24 horas por 20 dias e, posteriormente, os CMs foram fixados e manchados para marcadores específicos cardíacos, como troponina e marcadores do ciclo celular, como KI67.
Introduction
As doenças cardíacas são uma das principais causas de morte em todo o mundo. Quase todos os tipos de lesão cardíaca resultam em uma perda significativa de cardiomiócitos adultos (CMs). Corações de mamíferos adultos são incapazes de reparar sua lesão cardíaca devido à natureza senescente do cmadulto 1. Assim, qualquer insulto ao coração mamífero adulto resulta em uma perda permanente de CMs, levando à redução da função cardíaca e insuficiência cardíaca. Ao contrário dos mamíferos adultos, pequenos animais como zebrafish e newt hearts podem regenerar sua lesão cardíaca através da proliferação cm existente2,3,4. Um esforço mundial está em andamento para encontrar uma nova intervenção terapêutica para lesões cardíacas através de abordagens proliferativas e não proliferativas. Nas últimas décadas, vários tipos de modelos genéticos de camundongos foram desenvolvidos para estudar lesões cardíacas e reparos. No entanto, o uso de modelos in vivo animal continua a ser uma abordagem cara com a complexidade adicional para decifrar um mecanismo de célula-autônoma a partir de efeitos secundários. Além disso, os sistemas in vivo são desafiadores para analisar os efeitos específicos do CM de uma intervenção farmacológica que induz a sinalização cardioprotetora do CM.
Além disso, a cultura de longo prazo dos CMs adultos é necessária para realizar análises de proliferação de CM. Os ensaios de proliferação de CM requerem um mínimo de 4-5 dias para que as células sejam induzidas no ciclo celular e obtenham dados precisos depois disso. Além disso, estudos que utilizam CMs isolados para estudos eletrofisiológicos, triagem de medicamentos, estudos de toxicidade e estudos de homeostase Ca++ estão todos precisando de um sistema de cultura melhorado5,,6,7. Além disso, estudos recentes mostram a significância cardioprotetora das citocinas secretadas dos CMs (cardiocinas)8,9. Para investigar o papel terapêutico e o mecanismo molecular desses cardiocinas durante a reparação e regeneração cardíaca, é necessária uma cultura prolongada.
CMs de ratos adultos são robustos o suficiente para isolamento de células únicas e cultura de longo prazo em um sistema in vitro10,,11,,12. No entanto, os CMs de mouse adultos são de grande interesse para ensaios in vitro, devido à disponibilidade de uma variedade de modelos de mouse geneticamente modificados, o que permite o design e a execução de várias análises inovadoras que não são possíveis com o rato CM13. Em contraste com o isolamento cm de ratos adultos, é bastante desafiador obter uma suspensão unicelular de corações de ratos adultos, e a cultura de longo prazo de CMs de camundongos adultos na cultura é ainda mais desafiadora.
O isolamento cm adulto de corações de camundongos e ratos usando um sistema Langendorff foi previamente estabelecido para estudar a função CM5,,14,15. Aqui, descrevemos em detalhes os protocolos para o isolamento de CM adultos de ratos e camundongos, bem como uma cultura modificada a longo prazo, transfecção e proliferação de CM de células isoladas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há uma necessidade crítica de estabelecer um protocolo para o isolamento do cardiomiócito adulto e cultura de longo prazo para realizar estudos mecanicistas específicos para células. Existem apenas alguns relatórios discutindo protocolos de isolamento cm adulto, e ainda menos deles são usados para a cultura de longo prazo de camundongos adultos CM15,,16,17. É demonstrado que o cm de rato adulto tem maior tolerância à c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por financiamento do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade de Cincinnati, Faculdade de Medicina, ao Dr. Onur Kanisicak; uma subvenção dos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL148598) ao Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak é apoiado pelo American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). O Dr. Perwez Alam é apoiado pela bolsa de pós-doutorado da American Heart Association (AHA_20POST35200267). Dr. Malina J. Ivey é apoiada por uma bolsa NIH T32 (HL 125204-06A1).
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
Referências
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