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Artigo de método
Este protocolo descreve a clonagem e expansão de células T reguladoras humanas para a geração de Treg humano viável de pureza ultra-alta com desmetilação estável na região desmetilada específica de Treg (TSDR) e características fenotípicas específicas de Treg.
As células T reguladoras humanas (Treg) são notoriamente difíceis de isolar em alta pureza, dados os métodos atuais de enriquecimento de Treg. Esses métodos são baseados na identificação de Treg por meio de vários marcadores de superfície celular dependentes de ativação com níveis de expressão variados em diferentes condições fisiológicas e patológicas. As populações isoladas como "Treg", portanto, geralmente contêm um número considerável de células efetoras não-Treg (ou seja, Teff) que dificultam a caracterização fenotípica e funcional precisa dessas células, sua caracterização genômica e proteômica, sua enumeração confiável em diferentes estados de saúde e doença, bem como seu isolamento e expansão para fins terapêuticos. Este último, em particular, continua sendo um grande obstáculo, pois a expansão inadvertida das células efetoras em compartimentos celulares relevantes para Treg (por exemplo, células T CD4 + CD25 + ) pode tornar a imunoterapia baseada em Treg ineficaz ou mesmo prejudicial. Este trabalho apresenta um método que contorna os problemas associados ao isolamento e expansão de base populacional de Treg e mostra que a geração de clones candidatos a Treg com a subsequente seleção, cultura e expansão apenas de células monoclonais cuidadosamente examinadas, permite a geração de um produto de células Treg ultrapuro que pode ser mantido em cultura por muitos meses, permitindo a investigação a jusante dessas células, inclusive para possíveis aplicações terapêuticas.
O objetivo deste protocolo é permitir a propagação in vitro de Treg humano clonal de pureza ultra-alta. O isolamento de populações enriquecidas com Treg e a subsequente clonagem permitem a seleção dos fenótipos Treg desejados e sua expansão para um estudo mais aprofundado da biologia dessas células, exploração de sua potencial utilidade terapêutica e outras aplicações experimentais a jusante.
A clonagem de Treg produzirá uma pureza de Treg significativamente melhor do que as abordagens de isolamento e expansão policlonais. Isso se deve à exclusão confiável e controlada de células efetoras T com fenótipos se....
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Este protocolo segue todas as diretrizes institucionais relativas à conduta ética de pesquisas envolvendo o uso de amostras humanas. O trabalho com células humanas e outros produtos sanguíneos humanos deve ocorrer pelo menos em um ambiente certificado BSL-2, seguindo as diretrizes de segurança BLS-2, no mínimo.
1. Pré-enriquecimento de células mononucleares do sangue periférico humano para células CD4+CD127loCD25hi
CUIDADO: Use técnica estéril por toda parte. Descarte os objetos cortantes imediatamente em um recipiente apropriado para objetos cortan....
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A implementação bem-sucedida deste protocolo levará à geração de clones e linhagens de células T reguladoras humanas estáveis.
A pré-seleção / pré-enriquecimento de células CD4 + CD127loCD25hi foi um método direto para obter uma população inicial que continha a maioria dos Treg humanos (Figura 1A-C). Nem todos os clones exibiram um fenótipo Treg. A pré-triagem de clones por medição da expressão de CD25hi.......
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Este protocolo descreve a propagação de células T reguladoras humanas ultrapuras por meio do isolamento, expansão e verificação cuidadosa de células obtidas em uma diluição limitante e abordagem de expansão baseada em células alimentadoras de populações iniciais contendo Treg.
As etapas críticas nesta abordagem são: 1) a escolha de uma população inicial apropriada. Geralmente, o CD127ouCD25hi compartimento de células T CD4+ den.......
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Os autores não têm nada a divulgar.
Este projeto foi apoiado pelo National Eye Institute dos National Institutes of Health sob o prêmio número K08EY025324 (Nowatzky) e por um Colton Scholar Award do Judith and Stewart Colton Center for Autoimmunity (Nowatzky).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m Stericup, 500 mL | Millipore | 5500 | Armazenamento e preparação de mídia |
| 100x Aminoácidos não essenciais | Gibco | 11140-050 | Componente de mídia |
| 15 mL tubos de centrífuga cônicos (50/saco, caixa de 500) | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | Componente de mídia |
| 25 ml Bacia de pipeta de poço único | Fischer Scientific | 13-681-508 | |
| Tubo de Centrífuga Cônico de 50 mL (25/manga) | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50x Penicilina Estreptomicina Soln | Corning | Corning, 30-001-Cl | Componente de mídia |
| CryoTube Vial Int Rosca Redonda Btm Starfoot PP Parafuso Stopper Estéril PP 1.8 mL | Nalge Nunc | 377267 | |
| DMSO | Corning | 25-950-CQC | |
| Kit de seleção positiva EasySep Human CD25 | Stemcell Technologies | 18231 | As alternativas são a classificação baseada em colunas FACS ou MACS |
| EasySep Human CD4+CD127low T cell Pre-Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19231 | As alternativas são a classificação baseada em colunas FACS ou MACS |
| EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit (alternativa ao item 12) | Stemcell Technologies | 18063 | As alternativas são FACS ou MACS classificação baseada em coluna |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-5442-03 | PBMC purificação do sangue periférico de produtos de leucaférese; gradiente de densidade médio |
| Soro AB Humano (PHS-AB) | Valley Biomedical Inc | HP1022 | Componente de mídia |
| LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas Azuis Fixável, para excitação UV | Thermo Fischer | L-34962 | Corante |
| de viabilidadeFitohemaglutinina-L (PHA-L) | Millipore/Sigma | 11249738001 | estimulação de células T |
| IL-2 recombinante (por exemplo, PROLEUCINAâ ) | Prometheus | / Componente de mídia | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Componente de mídia |
| Anticorpos de coloração para citometria de fluxo (fenotipagem Treg) | Veja "Comentários" | Veja "Comentários" | Os anticorpos de coloração estão listados em: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. Caso seja usado o kit de seleção positiva para CD25 humano EasySep, core com anticorpo anti-CD25 2A3 ou BC96, por exemplo: anticorpo anti-CD25 humano Bright Violet 421 (Biolegend; 302629) |
| TCR Vβ Kit de Repertório; IOTest Beta Mark | Beckman Coulter | PN IM3497 | Verificação de expansões para monoclonalidade |
| Placa de Cultura de Tecidos, 96 Poços, Fundo em U com Tampa de Baixa Evaporação Corning | 353077 |
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