कोलोरेक्टल HT29 में ड्राइवर जीन की खोज-व्युत्पन्न कैंसर स्टेम की तरह ट्यूमरमंडल
Summary
यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल के लिए स्थापित कैंसर स्टेम की तरह कोलोरेक्टल HT29 कोशिकाओं से प्राप्त कोशिकाओं को बनाए रखने के अतिउप्रेरित चालक जीन की खोज है । उपलब्ध बायोइन्फॉर्मेटिक्स के साथ आरएनसीक्यू को लक्षित ट्यूमर कोशिकाओं के अस्तित्व में शामिल संभावित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए जीन अभिव्यक्ति नेटवर्क की जांच और स्क्रीन करने के लिए किया गया था।
Abstract
कैंसर स्टेम सेल नैदानिक चिकित्सा के खिलाफ एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, ट्यूमर पतन के लिए योगदान । ट्यूमरजीनेसिस और कैंसर स्टेमनेस गुणों की शुरुआत में कई ऑन्कोजीन शामिल हैं। चूंकि कोलोरेक्टल कैंसर से व्युत्पन्न ट्यूमरमंडल के गठन में जीन अभिव्यक्ति अस्पष्ट है, इसलिए एक समय में एक जीन पर काम करने वाले तंत्रों की खोज करने में समय लगता है। यह अध्ययन कोलोरेक्टल कैंसर स्टेम की तरह विट्रो के अस्तित्व में शामिल चालक जीन को जल्दी से खोजने के लिए एक विधि को दर्शाता है । कोलोरेक्टल HT29 कैंसर कोशिकाओं है कि LGR5 व्यक्त जब spheroids के रूप में सुसंस्कृत और एक वृद्धि CD133 स्टेमनेस मार्कर के साथ चयनित और इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया । प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कोलोरेक्टल एचटी29-व्युत्पन्न स्टेम-जैसे ट्यूमरस्फीयर के गठन में ओवरएक्सप्रेस्ड ड्राइवर जीन को जल्दी से उजागर करने के लिए उपलब्ध बायोइन्फॉर्मेटिक्स के साथ आरएनएएसेक प्रदर्शन करने के लिए किया जाता है। कार्यप्रणाली जल्दी से स्क्रीन और अन्य रोग मॉडल में संभावित चालक जीन की खोज कर सकते हैं।
Introduction
कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) दुनिया भर में उच्च व्यापकता और मृत्यु दर के साथ मौत का एक प्रमुख कारण है1,,2। जीन उत्परिवर्तन और प्रवर्धन के कारण, कैंसर कोशिकाएं प्रसार नियंत्रण के बिना बढ़ती हैं, जो सेल अस्तित्व3,एंटी-एपोप्टोसिस4और कैंसर स्टेमनेस5,,6, 7,7में योगदान देती हैं। ट्यूमर ऊतक के भीतर, ट्यूमर विषमता ट्यूमर कोशिकाओं को चिकित्सीय उपचार 8 केदौरानअनुकूलित और जीवित रहने की अनुमति देती है। कैंसर स्टेम सेल (सीएससी), अंतर कैंसर प्रकार की तुलना में आत्म नवीकरण और pluripotency की एक उच्च दर के साथ, ट्यूमर पुनरावृत्ति9,,10 और मेटास्टैटिक सीआरसी11के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार हैं । सीएससी अधिक दवा,प्रतिरोध12, 13,,14और एंटी-एपोप्टोसिस गुण14 15,,16,इस प्रकार ट्यूमर कीमोथैरेपी जीवित है।
यहां, चयनित सीआरसी स्टेम कोशिकाओं में स्टेमनेस के लिए संभावित तंत्र की जांच करने के लिए, आरएनसीक्यू को ट्यूमर स्फेरॉइड में अलग-अलग व्यक्त जीन को स्क्रीन करने के लिए किया गया था। कैंसर कोशिकाएं कम पालन की स्थिति में उगाई जाने पर गोलाकार (जिसे ट्यूमरस्फीयर भी कहा जाता है) बना सकती हैं और ईजीएफ, टीएफजीएफ, एचजीएफ और आईएल6 सहित सुसंस्कृत माध्यम में जोड़े गए विकास कारकों से प्रेरित होती हैं। इसलिए, हमने सीआरसी एचटी29 ट्यूमर कोशिकाओं का चयन किया जो ऑक्सलिप्लैटिन और इरिनोटकॉन17के साथ इलाज करते समय फॉस्फोरिलेटेड स्टेट3 में वृद्धि के साथ कीमोथेरपी का विरोध करते हैं। इसके अलावा, HT29 उच्च स्टेमनेस मार्कर व्यक्त किया जब वर्णित संस्कृति की स्थिति में सुसंस्कृत । एचटी29-व्युत्पन्न सीएससी मॉडल ने लेउसिन-रिच रिपीट-युक्त जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 5 (एलजीआर 5)18,सीआरसी स्टेम सेल19,,20का एक विशिष्ट मार्कर व्यक्त किया । इसके अलावा, कैंसर स्टेम सेल के लिए एक सामान्य बायोमार्कर माना जाता है, CD133भी HT29 सेल लाइन21में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य22के व्यक्तिगत ऑन्कोजीन की जांच करने के विपरीत बायोइन्फॉर्मेटिक्स डेटासेट के आधार पर स्थापित कैंसर स्टेम जैसे ट्यूमरस्फीयर में ड्राइवर जीन के समूहों की खोज करना है। यह आरएनसीक्यू विश्लेषण के माध्यम से संभावित आणविक तंत्रों की जांच करता है जिसके बाद उपलब्ध बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण होते हैं ।
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण एक उच्च थ्रूपुट, आसानी से उपलब्ध है, और विश्वसनीय डीएनए अनुक्रमण विधि कंप्यूटेशनल मदद के आधार पर, ट्यूमर चिकित्सा23मार्गदर्शन के लिए व्यापक रूप से चालक जीन स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया । इस तकनीक का उपयोग एक पृथक आरएनए नमूने24के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन से जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए भी किया जाता है । हालांकि, जब RNAseq के साथ स्क्रीनिंग, चिकित्सा के साथ लक्षित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण जीन प्रयोगात्मक और नियंत्रण के नमूनों के बीच उच्चतम अभिव्यक्ति अंतर नहीं हो सकता है । इसलिए, केजीजी 25 , जीओ,26 , 27या पैंथर2628 जैसे वर्तमान डेटासेट28के आधार पर जीन को वर्गीकृत करने और पहचानने के लिए कुछ जैव सूचनाएं विकसित की गईं, जिनमें सरलता पाथवे विश्लेषण (आईपीए)29 और नेटवर्कएनालिस्ट30शामिल हैं ।27 यह प्रोटोकॉल माता-पिता HT29 कोशिकाओं की तुलना में चयनित HT29-व्युत्पन्न स्फेरॉइड में जीन के एक समूह को जल्दी से खोजने के लिए आरएनएसेक और नेटवर्कएनालिस्ट के एकीकरण को दर्शाता है। महत्वपूर्ण जीन में अंतर की खोज के लिए अन्य रोग मॉडलों के लिए इस विधि का आवेदन करने का भी सुझाव दिया गया है।
व्यक्तिगत जीन अभिव्यक्ति की जांच की तुलना में, एक उच्च थ्रूपुट तकनीक ट्यूमर सटीक दवा के लिए आसानी से संभावित चालक जीन खोजने के लिए लाभ प्रदान करती है। केजीजी, गो या पैंथर जैसे उपयोगी डेटासेट के साथ, विशिष्ट जीन को रोग मॉडल, सिग्नलिंग रास्ते, या विशिष्ट कार्यों के आधार पर पहचाना जा सकता है, और यह जल्दी से विशिष्ट, महत्वपूर्ण जीन पर ध्यान केंद्रित करने, समय और अनुसंधान लागत की बचत करने की अनुमति देता है। इसी तरह के आवेदन का प्रयोग पिछले अध्ययनों में किया जाता है, 14,18,31. विशेष रूप से, एक ट्यूमर अधिक जटिल है क्योंकि ट्यूमर के विभिन्न प्रकार के अस्तित्व और प्रसार के लिए जीन और रास्ते भेद व्यक्त करते हैं। इसलिए, यह प्रोटोकॉल विभिन्न परिस्थितियों में विभिन्न ट्यूमर प्रकारों को अलग करने वाले जीन उठा सकता है। विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति के तंत्र को समझकर कैंसर के खिलाफ प्रभावी रणनीतियां खोजने की क्षमता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, सुसंस्कृत कैंसर स्टेम जैसे ट्यूमरमंडलों को उपलब्ध बायोइन्फॉर्मेटिक्स के साथ आरएनसीक्यू डेटा का विश्लेषण करने में एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया था। एक रोग मॉडल के लिए, HT29-व्युत्पन…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक तकनीकी सहायता के लिए इंस्टीट्यूट फॉर रेडियोलॉजिकल रिसर्च, चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल के विकिरण जीव विज्ञान कोर प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करते हैं । इस अध्ययन को चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल (CMRPD1J0321), चेंग हसीन जनरल अस्पताल (CHGH 106-06), और मैके मेमोरियल अस्पताल (एमएमएच-सीटी-१०६०५ और एमएमएच-106-61) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । फंडिंग निकायों का अध्ययन और डेटा संग्रह, विश्लेषण और डेटा की व्याख्या या पांडुलिपि लिखने के डिजाइन में कोई प्रभाव नहीं था।
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
Referências
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
- Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
- Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
- Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
- Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
- Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
- Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
- Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
- Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
- Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
- Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Pesquisa do Câncer. 69 (5), 1951-1957 (2009).
- Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
- Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
- Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
- Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
- Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
- Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
- Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
- Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
- Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
- Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
- Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
- The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
- Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).
- Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
- Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
- Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
