O objetivo é fracionar e isolar pequenas moléculas bioativas, peptídeos de um complexo extrato vegetal e proteínas de micróbios patogênicos, empregando o método de focalização isoelétrica de fase líquida (IEF). Além disso, as moléculas separadas foram identificadas e sua bioatividade confirmada.
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Artigo de método
Separação de Pequenas Moléculas Bioativas, Peptídeos de Fontes Naturais e Proteínas de Micróbios pelo Método De Foco Isoelétrico Preparatório (IEF)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Produtos naturais derivados de plantas e micróbios são uma rica fonte de moléculas bioativas. Antes de seu uso, as moléculas ativas de extratos complexos devem ser purificadas para aplicações a jusante. Existem vários métodos cromatográficos disponíveis para este fim, mas nem todos os laboratórios podem pagar métodos de alto desempenho e o isolamento de amostras biológicas complexas pode ser difícil. Aqui demonstramos que o foco isoelétrico de fase líquida (IEF) pode separar moléculas, incluindo pequenas moléculas e peptídeos de extratos de plantas complexas, com base em seus pontos isoelétricos (iI). Utilizamos o método para fracionamento e caracterização de amostras biológicas complexas. Como prova de conceito, fracionamos um extrato de planta gymnema sylvestre, isolando uma família de pequenas moléculas terpenoides de sapono e um peptídeo. Também demonstramos uma separação eficaz de proteína microbiana usando o fungo Candida albicans como um sistema modelo.
Introdução
A purificação de biomoléculas a partir de amostras biológicas complexas é um passo essencial e muitas vezes difícil em experimentos biológicos1. O foco isoelétrico (IEF) é adequado para a separação em alta resolução de biomoléculas complexas onde os amfolitos portadores viajam de acordo com sua carga e estabelecem o gradiente de pH em um campo elétrico3. O primeiro ampholyte de transportadora comercial para IEF foi desenvolvido por Olof Vesterberg em 1964 e patenteado4,5. Os amfolitos portadores são moléculas de ácido oligo-carboxílico alifático de comprimento e ....
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Protocolo
1. Configuração e pré-ressarificação da unidade IEF de fase líquida padrão
- Monte os eletrodos IEF de fase líquida (botão vermelho-ânodo e botão cathode-preto) com suas respectivas membranas de troca de acordo com o manual de instruções (ver Tabela de Materiais). Equilibre as membranas de troca de ânion com 0,1 M NaOH e as membranas de troca de cáção com 0,1 M H3PO4 pelo menos por 16 h quando novas membranas são usadas.
- Armazene as membranas em eletrólitos (0,1 M NaOH ou 0,1 M H3PO4) entre as corridas e não deixe secar.
- Monte a porção interna e externa do eletrodo alin....
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Resultados
Separação e purificação de pequenas moléculas e peptídeos do extrato vegetal de Gymnema sylvestre
Usando o método de IEF de fase líquida preparatória, fracionamos extratos de plantas medicinais e proteínas da superfície celular de um fungo patogênico humano, C. albicans. Um esquema desses protocolos de fracionamento é mostrado na Figura 1.
A partir de 20 frações de extrato g. sylvestre obtidos a partir de IEF de fase .......
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Discussão
Pequenas moléculas de fontes de produtos naturais (por exemplo, plantas) incluem metabólitos secundários complexos que são altamente diversos em estrutura química. Acredita-se que estejam envolvidos em mecanismos de defesa de plantas. Além disso, os polipeptídeos também estão presentes nos tecidos vegetais22. Essas pequenas moléculas de produtos naturais são fontes ricas de moléculas de teste para descoberta e desenvolvimento de drogas. No entanto, os métodos difíceis e tediosos necessários para s.......
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Divulgações
Os autores gostariam de declarar que não há interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Somos gratos pelas fontes de financiamento da Divisão de Biologia e johnson Cancer Research Center para prêmios BREVE e IRA, respectivamente para gv. Agradecemos também o prêmio de pós-doutorado K-INBRE à RV. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de bolsas P20 GM103418. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais ou dos Institutos Nacionais de Saúde. Agradecemos aos revisores anônimos por seus comentários úteis.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,45 µ m filtro de seringa | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma | M3148 | |
| Carbonato de amônio | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Anfólito | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Anfólito | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Termostato compacto de baixa temperatura | Lauda - Brinkmann | RM 6T | Defina o resfriamento a água para 4 oC e pode ser executado mesmo a 0 oC, pois quando passa pelo núcleo de resfriamento Rotofor, a temperatura da água circulante será de cerca de 5 ou mais, dependendo da tensão. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Extrato de folha de planta Gymnema em pó (>25% de ácidos gimnêmicos) | Suan Farma, NJ EUA | ||
| Incubadora | Companheiro de laboratório | SI 300R | |
| Microscópio | Leica | DM 6B | |
| Mini proteano medidor de pH para eletroforese | Bio-Rad | ||
| Mettler Toledo | S20 | Útil para determinar o pH das frações Rotofor (IEF em fase líquida) | |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Manual de instruções para montagem da unidade) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Fita de vedação | Bio-Rad | 170-2960 | A fita adesiva também pode ser usada. |
| Sorvall legend micro 17 centrífuga | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP placa de cultura de tecidos -96 poços fundo plano | TPP | TP92696 |
Referências
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Poin....
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Reimpressões e permissões
