Live-Cell Imaging af livscyklus bakteriel Predator Bdellovibrio bacteriovorus ved hjælp af Time-Lapse Fluorescens mikroskopi

Summary

Præsenteret her er en protokol, der beskriver overvågning af hele livscyklus aggressiv bakterie Bdellovibrio bakterien ved hjælp af time-lapse fluorescens mikroskopi i kombination med en agarose pad og celle-imaging retter.

Abstract

Bdellovibrio bacteriovorus er en lille gram-negativ, forpligte aggressiv bakterie, der dræber andre gram-negative bakterier, herunder skadelige patogener. Derfor er det betragtes som et levende antibiotikum. At anvende B. bacteriovorus som et levende antibiotikum, er det først nødvendigt at forstå de store faser af sin komplekse livscyklus, især dens spredning inde bytte. Hidtil har det været udfordrende at overvåge på hinanden følgende stadier af aggressiv livscyklus i realtid. Præsenteret her er en omfattende protokol for real-time billeddannelse af hele livscyklus B. bacteriovorus, især under sin vækst inde i værten. Til dette formål anvendes et system bestående af en agarosepude i kombination med cellebilleddannelsesretter, hvor de rovfugleceller kan bevæge sig frit under agarosepuden, mens immobiliserede bytteceller er i stand til at danne bdelloplasts. Anvendelsen af en stamme, der frembliker en fluorescerende mærket β-underenhed af DNA polymerase III yderligere gør det muligt kromosom replikation, der skal overvåges i reproduktionsfasen af B. bakteriens livscyklus.

Introduction

Bdellovibrio bacteriovorus er en lille (0,3-0,5 μm med 0,5-1,4 μm) gram-negativ bakterie, der udnytter andre gram-negative bakterier, herunder skadelige patogener såsom Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, og Shigella flexneri^1,2,3. Da B. bacteriovorus dræber patogener, det betragtes som en potentiel levende antibiotikum, der kan anvendes til bekæmpelse af bakterielle infektioner, især dem forårsaget af multiresistente stammer.

B. bacteriovorus udviser en ejendommelig livscyklus bestående af to faser: en fritlevende ikke-replikeret angrebsfase og en intracellulær forplantningsfase (Figur 1). I den fritlevende fase søger denne meget motile bakterie, som bevæger sig med hastigheder på op til 160 μm/s, efter sit bytte. Efter fastgørelse til byttets ydre membran kommer den ind i periplasmen^4,5. I den interperiplasmiske forplantningsfase bruger B. bacteriovorus et væld af hydrolytiske enzymer til at nedbryde værtens makromolekyler og genbruge dem til sin egen vækst. Kort efter at invadere periplasma, værtscellen dør og oppustethed i en sfærisk struktur kaldet en bdelloplast, inden for hvilken den aggressiv celle forlænger og replikerer sine kromosomer. Replikeringsprocessen starter ved replikeringsstarten (oriC)⁶ og fortsætter, indtil flere kopier af kromosomet er blevet fuldstændig syntetiseret⁷. Interessant, replikation af hvert kromosom er ikke efterfulgt af celledeling. I stedet rovdyrlanger til at danne en lang, multinucleoid og filamentous celle. Ved næringsstofudtynding gennemgår glødetråden synkron septation, og afkomceller frigives fra bdelloplast⁸.

Før B. bacteriovorus kan bruges som et levende antibiotikum mod bakterielle infektioner, er det afgørende at forstå de store faser af sin livscyklus, især dem, der vedrører dens spredning inde i byttet. Live-celle billeddannelse af B. bacteriovorus har været udfordrende, på grund af de forskellige morfologiske former for rovdyr og dets bytte i den komplekse livscyklus. Hidtil har samspillet mellem B. bacteriovorus og dens værtscelle er hovedsageligt blevet undersøgt ved elektronmikroskopi og snap-shot analyse^2,9,10, som begge har begrænsninger, især når de bruges til at overvåge på hinanden følgende stadier af aggressiv livscyklus. Disse metoder giver billeder i høj opløsning af B. bacteriovorus celler og muliggøre observation af et lille rovdyr under angrebet eller vækstfasen. Men, de tillader ikke sporing af enkelt B. bakteriovorus celler i begge livscyklus faser.

Præsenteret her er en omfattende protokol for brug af time-lapse fluorescens mikroskopi (TLFM) til at overvåge hele livscyklus B. bacteriovorus. Et system bestående af en agarosepude anvendes i kombination med en cellebilledskål, hvor de rovfugleceller kan bevæge sig frit under agarosepuden, mens de immobiliserede bytteceller er i stand til at danne bdelloplasts (Figur 2). Denne opsætning er udarbejdet på grundlag af specifikke stammer af både E. coli og B. bacteriovorus, men protokollen kan let ændres, så den passer til en brugers individuelle stammer (f.eks med forskellige udvælgelsesmarkører, proteiner sammensmeltet med forskellige fluorophores osv.).

I dette tilfælde, at visualisere B. bacteriovorus under angrebet fase, en bestemt stamme (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) blev konstrueret, der udtrykker en fluorescerende mærket version af cytoplasmatisk protein, PilZ (tilgængelig i vores laboratorium efter anmodning)⁷. Denne stamme desuden producerer DnaN (β-glidende klemme), en underenhed af DNA polymerase III holoenzym, fusioneret med en fluorescerende protein. Dette gør det muligt løbende DNA replikation, der skal overvåges inde i aggressiv celler, som de vokser inden for bdelloplasts.

Selv om den beskrevne protokol og software, der anvendes til billederhvervelse, henviser til et omvendt mikroskop fra en bestemt producent (se Tabelover Materialer), kan denne teknik justeres for ethvert omvendt mikroskop, der er udstyret med et miljøkammer eller en anden ekstern varmeholder, og som kan foretage time-lapse-billeddannelse. Til dataanalyse kan brugerne vælge tilgængelig software, der er kompatibel med de enkelte outputformater.

Figur 1: B. bacteriovorus livscyklus i E. coli som værtscelle. Under angrebet fase, en fri-svømning B. bacteriovorus celle søger efter og tillægger en vært E. coli celle. Efter invasionen bliver den rovcelle lokaliseret i byttets periplasme, hvilket ændrer værtscellens form og danner en bdelloplast. Den reproduktive fase starter med bdelloplast dannelse. Den aggressiv celle fordøjer byttecellen og genbruger simple forbindelser til at bygge sine egne strukturer. B. bacteriovorus vokser som en lang enkelt glødetråd inde i værtens periplasm. Når byttecellens ressourcer er opbrugt, b. bakterienus glødetråd synkront septater og danner afkom celler. Efter afkomceller udvikle deres flagella, de lyse bdelloplast. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. Præparat af B. bakterieiovorus lysat til mikroskopisk analyse I en 250 ml kolbe skal coculture ved at kombinere 1 ml frisk 24 h B. bakterieiovoruskultur (f.eks. E. coli S17-1 pZMR100) med 50 ml Ca-HEPES buffer (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7.6]) suppleret med antibiotika, når det er nødvendigt (her, 50 μg/mL kanamycin). Kolbonnende i 24 timer ved 30 °C med omrystning ved 200 omdrejninger. Kontroller, at byttecellerne er fuldt lyset af væskemont…

Representative Results

Det beskrevne TLFM-baserede system gør det muligt at spore individuelle celler af B. bakterieædre i tide (Figur 3, Film 1) og giver værdifulde oplysninger om hver fase af den komplekse aggressiv livscyklus. PilZ-mCherry-fusionen gør det muligt at mærke hele den rovcelle i angrebsfasen samt den tidlige fase af vækstfasen (figur 3). Overgangen fra angrebet til replikativ fase blev visualiseret ikke kun af værten bdelloplast dannels…

Discussion

På grund af den øgede interesse i at bruge B. bacteriovorus som et levende antibiotikum, nye værktøjer til at observere aggressiv livscyklus, især rovdyr-patogen interaktioner, er nødvendige. Den præsenterede protokol bruges til at spore hele B. bakteriens livscyklus, især under sin vækst inde i værten, i realtid. Desuden, anvendelse af en stamme, der producerer fluorescerende mærket beta klemme af DNA polymerase III holoenzyme aktiveret overvågning af kromosom replikation progression i hele…

Materials

Centrifuge	MPW MED. INSTRUMENTS	MPW-260R	Rotor ref. 12183
CertifiedMolecular Biology Agarose	BIO-RAD	161-3100	low fluorescence agarose for agarose pad
Fiji	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Open source image processing package
Glass Bottom Dish 35 mm	ibidi	81218-200	uncoated glass
Microscope	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Minisart Filter 0.45 µm	Sartorius	16555———-K	Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet
Start SoftWoRx	GE		Manufacturer-supplied imaging software