시간 경과 형광 현미경 검사를 사용하여 세균 육식 동물 Bdellovibrio 박테리오보루스의 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징
Summary
여기에 제시된 것은 아가로즈 패드 및 세포 화상 진찰 접시와 함께 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 약탈적인 박테리아 Bdellovibrio bacteriovorus의 완전한 수명 주기의 감시를 기술하는 프로토콜입니다.
Abstract
Bdellovibrio bacteriovorus는 유해한 병원체를 포함하여 그밖 그람 음성 박테리아를 죽이는 작은 그람 음성, 의무 약탈 박테리아입니다. 따라서 살아있는 항생제로 간주됩니다. 살아있는 항생제로 B. bacteriovorus를 적용하려면, 그것의 복잡한 수명 주기의 주요 단계를 이해하는 것이 첫째로, 특히 먹이 안쪽의 증식. 지금까지, 그것은 실시간으로 약탈 생활 주기의 연속 단계를 모니터링 하는 도전 하고있다. 여기에 소개되는 것은 B. bacteriovorus의전체 수명 주기의 실시간 이미징을 위한 포괄적인 프로토콜입니다, 특히 호스트 내부의 성장 도중. 이를 위해 아가로즈 패드로 구성된 시스템은 세포 이미징 접시와 함께 사용되며, 이 요리는 고정된 먹이 세포가 bdelloplasts를 형성할 수 있는 동안 약탈 세포가 아가로즈 패드 아래에서 자유롭게 이동할 수 있습니다. DNA 폴리머라제 III의 형광 태그 β-서브유닛을 생성하는 균주의 적용은 B. bacteriovorus 수명 주기의 재생 단계에서 염색체 복제를 모니터링할 수 있게 한다.
Introduction
Bdellovibrio bacteriovorus는 작은 (0.3-0.5 μm x 0.5-1.4 μm) 그람 음성 박테리아는 클렙시엘라 폐렴, 슈도모나스 아에루기노사, , 시글라 플렉너리1,2,3등 유해한 병원균을 포함한 다른 그램 음성 박테리아에 먹이를 주는 작은 박테리아입니다.3 B. bacteriovorus병원체를 죽이기 때문에, 세균감염을 방지하기 위하여 적용될 수 있는 잠재적인 살아있는 항생제로 간주됩니다, 특히 다제 저항하는 긴장에 기인한 그들.
B. 박테리오보루스는 2단계로 구성된 특이한 수명 주기를 나타낸다: 자유로운 살아있는 비복제 공격 단계 및 세포내 생식단계(그림 1). 자유 생활 단계에서 최대 160 μm /s의 속도로 움직이는이 매우 운동성 박테리아는 먹이를 검색합니다. 먹이의 외부 멤브레인에 부착 한 후, 그것은4주변4,5로들어간다. 인터페리플라스믹 생식 단계 동안, B. bacteriovorus는 숙주의 거대 분자를 저하시키고 자신의 성장을 위해 재사용하기 위해 다양한 가수 분해 효소를 사용합니다. 곧 주변을 침공 한 후, 호스트 세포는 죽고 약탈 세포가 염색체를 복제 내부 bdelloplast라는 구형 구조로 팽창. 복제 프로세스는 복제 원점에서시작(oriC)6 염색체의 여러 복사본이 완전히 합성 될 때까지진행 7. 흥미롭게도, 각 염색체의 복제는 세포 분열뒤에 선행되지 않습니다. 대신, 육식 동물은 길고 다중 핵및 필라멘트 세포를 형성하기 위해 길게 합니다. 영양 고갈시 필라멘트는 동기 정화를 거치고 자손 세포는 bdelloplast8에서방출됩니다.
B. bacteriovorus 세균성 감염에 대하여 살아있는 항생제로 이용될 수 있기 전에, 그것의 생활 주기의 중요한 단계, 특히 먹이 안쪽에 그것의 증식과 관련되었던 그 이해하는 것이 중요합니다. B. bacteriovorus의 살아있는 세포 화상 진찰은 복잡한 생활 주기 도중 포식자의 각종 형태및 그것의 먹이 때문에 도전되었습니다. 지금까지, B. bacteriovorus와 그것의 호스트 세포 사이 상호 작용은 주로 전자 현미경 검사법과 스냅 샷 분석에 의해 공부되었습니다22,9,,10,둘 다 한계가 있는, 특히 때 그들은 약탈 수명 주기의 연속적인 단계를 감시하는 데 이용되는 경우에. 이러한 방법은 B. bacteriovorus 세포의 고해상도 이미지를 제공하고 공격 또는 성장 단계 동안 작은 육식 동물의 관찰을 가능하게한다. 그러나, 그들은 두 수명 주기 단계에 걸쳐 단일 B. bacteriovorus 세포의 추적을 허용하지 않습니다.
여기에 제시된 것은 시간 경과 형광 현미경 검사법(TLFM)을 사용하여 B. bacteriovorus의전체 수명 주기를 모니터링하기 위한 포괄적인 프로토콜이다. 아가로즈 패드로 구성된 시스템은 세포 이미징 접시와 함께 사용되며, 이 에 고정된 먹이 세포는 보엽성형을 형성할 수 있는 동안 약탈세포가 아가로즈 패드 아래에서 자유롭게 이동할 수있다(도 2). 이러한 설정은 대장균과 B. 박테리오보루스의특정 균주에 따라 제조되지만, 프로토콜은 사용자의 개별 균주에 맞게 쉽게 변경될 수 있습니다(예: 다른 선택 마커, 다른 형광구와 융합된 단백질 등).
이 경우, 공격 단계에서 B. bacteriovorus를 시각화하기 위해, 특정 균주(HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry)는 세포질 단백질, PilZ(요청 시 실험실에서 사용가능)의형광태그 버전을 표현하는 것으로 구성되었다. 이 균주는 추가로 DNAN (β 슬라이딩 클램프), DNA 폴리머라제 III 홀로효소의 하위 단위, 형광 단백질과 융합을 생성합니다. 이것은 그들이 bdelloplasts 내에서 성장으로 약탈 세포 내부를 모니터링하는 지속적인 DNA 복제를 가능하게.
이미지 수집에 사용되는 기술 프로토콜 및 소프트웨어는 특정 제조업체가 제공하는 반전 된 현미경을 참조하지만 (재료의 표참조), 이 기술은 환경 챔버 또는 기타 외부 가열 홀더가 장착 된 모든 반전 현미경에 대해 조정 될 수 있으며 시간 경과 이미징이 가능합니다. 데이터 분석의 경우 사용자는 개별 출력 형식과 호환되는 사용 가능한 소프트웨어를 선택할 수 있습니다.
도 1: 대장균에서 항균의 생물 주기가 숙주 세포로서. 공격 단계 동안, 자유 수영 B. 박테리오보루스 세포는 호스트 대장균 세포에 검색하고 부착합니다. 침공 후, 약탈 세포는 먹이의 주변에 국한되어 숙주 세포의 모양을 변경하고 bdelloplast를 형성합니다. 생식 단계는 bdelloplast 형성으로 시작됩니다. 약탈 세포는 먹이 세포를 소화하고 자신의 구조를 구축하기 위해 간단한 화합물을 재사용합니다. B. 박테리오보루스는 호스트의 주변지 에서 긴 단일 필라멘트로 성장합니다. 먹이 세포의 자원이 소진되면 B. 박테리오보루스 필라멘트는 동기적으로 패혈증을 형성하고 자손 세포를 형성합니다. 자손 세포가 기조세포를 개발한 후, 그들은 bdelloplast를 lyse. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
살아있는 항생제로 B. bacteriovorus를 사용에 증가 하는 관심으로 인해, 약탈 수명 주기를 관찰 하기 위한 새로운 도구, 특히 육식-병원 체 상호 작용, 필요. 제시된 프로토콜은 전체 B. bacteriovorus 수명 주기를 추적하는 데 사용되며, 특히 호스트 내부의 성장 중에 실시간으로 사용됩니다. 더욱이, DNA 폴리머라제 III 홀로자임의 형광 태그 베타 클램프를 생성하는 균주의 적용은 B. bacteriov…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 과학 센터 보조금 Opus에 의해 지원 되었다 2018/29/B/NZ6/00539 J.Z.C.
Materials
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555———-K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
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