Brug af magnetometri til at overvåge cellulær inkorporering og efterfølgende bionedbrydning af kemisk syntetiserede jernoxidnanopartikler
Summary
Jernoxid nanopartikler syntetiseres via en nonaqueous sol gel procedure og belagt med anioniske korte molekyler eller polymer. Brugen af magnetometri til overvågning af inkorporering og biotransformationer af magnetiske nanopartikler i menneskelige stamceller demonstreres ved hjælp af et vibrerende prøvemagnetometer (VSM).
Abstract
Magnetiske nanopartikler, lavet af jernoxid, udgør en ejendommelig interesse for en bred vifte af biomedicinske applikationer, som de ofte internaliseres i celler og derefter efterlades inden for. En udfordring er at vurdere deres skæbne i det intracellulære miljø med pålidelige og præcise metoder. Heri introducerer vi brugen af det vibrerende prøvemagnetometer (VSM) til præcist at kvantificere integriteten af magnetiske nanopartikler i celler ved at måle deres magnetiske øjeblik. Stamceller er først mærket med to typer magnetiske nanopartikler; nanopartiklerne har den samme kerne, der produceres via en hurtig og effektiv mikrobølgebaseret nonaqueous sol gelsyntese og adskiller sig i deres belægning: det almindeligt anvendte citronsyremolekyle sammenlignes med polyacrylsyre. Dannelsen af 3D-celle-sfæroider opnås derefter via centrifugering, og det magnetiske øjeblik af disse sfæroider måles på forskellige tidspunkter med VSM. Det opnåede øjeblik er et direkte fingeraftryk af nanopartiklernes integritet med faldende værdier, der indikerer en nanopartikelforringelse. For begge nanopartikler falder det magnetiske øjeblik over kulturtid og afslører deres bionedbrydning. En beskyttende virkning af polyacrylsyrebelægningen vises også sammenlignet med citronsyre.
Introduction
Der er øget interesse for de magnetiske træk ved jernoxid nanopartikler til en bred vifte af biomedicinske applikationer. Deres reaktion på magnetisk resonans gør dem pålidelige kontraststoffer til magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), en fordel i regenerativ medicin, hvor celler mærket med magnetiske nanopartikler kan spores in vivo efter implantation1. Ved hjælp af magnetiske felter kan celler også styres på afstand; på denne måde kan cellulære sfæroider2,3, ringe4eller ark5 konstrueres magnetisk og også fjernt stimuleret6, et aktiv i udviklingen af stilladsfri væv. Rækken af muligheder for disse nanopartikler omfatter også narkotikaleveringssystemer7,8 og magnetisk og fotoinduceret hypertermisk behandling for at dræbe kræftceller9,10,11. Til alle disse applikationer er nanopartiklerne integreret i det biologiske miljø enten ved intravenøs injektion eller via direkte internalisering i celler og efterlades derefter inden for, hvilket sætter spørgsmålstegn ved deres intracellulære skæbne.
In vivo-analyser formidlede en generel forståelse af nanopartiklernes skæbne i organismen: Ved injektion i blodbanen fanges de først mest af leverens makrofager (Kupffer-celler), milt og knoglemarv nedbrydes gradvist og slutter sig til organismens jernpulje12,13,14,15,16,17,18,19. Kvalitative observationer er kun mulige på grund af cirkulationen af nanopartiklerne i hele organismen. Typisk kan elektronisk transmissionsmikroskopi (TEM) bruges til direkte at observere nanopartiklerne, og tilstedeværelsen af jern i organerne kan bestemmes ved dosering. For nylig er deres skæbne blevet vurderet direkte på en pulje af celler, hvilket betyder i tæt kredsløb uden jernflugt, hvilket giver mulighed for en kvantitativ måling af deres biotransformationer på celleniveau20,21,22. Sådanne målinger er mulige gennem analyse af nanopartiklernes magnetiske egenskaber, der er tæt forbundet med deres strukturelle integritet. Vibrerende prøvemagnetometri (VSM) er en teknik, hvor prøven vibrerer med jævne mellemrum, således at spolemålingen af den inducerede flux giver prøvens magnetiske øjeblik ved det påførte magnetfelt. En sådan synkron detektion giver mulighed for en hurtig måling, som er et aktiv til bestemmelse af de magnetiske øjeblikke i et stort antal prøver20,21,22,23. Den makroskopiske magnetiske signatur, der hentes af VSM, giver derefter et kvantitativt overblik over hele den biologiske prøve, der er direkte korreleret med nanopartiklernes størrelse og struktur. Det giver især prøvernes magnetiske øjeblik ved mætning (udtrykt i emu), som er en direkte kvantificering af antallet af magnetiske nanopartikler, der er til stede i prøven, henholdsvis til deres specifikke magnetiske egenskaber.
Det har vist sig, at den intracellulære behandling af magnetiske nanopartikler er tæt forbundet med deres strukturelle egenskaber20. Disse funktioner kan styres via optimale synteseprotokoller. Hver protokol indeholder fordele og begrænsninger. Jernoxid nanopartikler er almindeligt syntetiseret i vandige opløsninger via coprecipitation af jernioner24. For at overvinde begrænsningerne af nanopartikler størrelse polydispersitet, andre syntese metoder såsom polyol-medieret sol-gel metoder er blevet udviklet25. Nonaqueous tilgange ved termisk nedbrydning fører til produktion af meget godt kalibreret jernoxid nanopartikler26. Brugen af massive mængder overfladeaktive stoffer som oleylamin eller oliesyre komplicerer imidlertid deres funktionalisering og vandoverførsel til biomedicinske anvendelser. Af denne grund syntetiserer vi sådanne magnetiske nanopartikler gennem en nonaqueous sol gel-rute, der fører til høj krystallinitet, renhed og reproducerbarhed27. Denne protokol producerer velkontrollerede nanopartikler i størrelse, der kan indstilles gennem temperaturvariation28. Ikke desto mindre har den mikrobølgestøttede ikke-vandige sol-gel-rute en øvre størrelsesgrænse for de opnåede nanopartikler på ca. 12 nm. Denne procedure vil ikke blive tilpasset til anvendelser, der anvender ferromagnetiske partikler ved stuetemperatur. Ud over kernesyntesen er et andet hovedtræk, der skal overvejes, belægningen. Belægningen ligger på overfladen af nanopartiklerne og fungerer som et forankringsmolekyle, der hjælper med målrettet internalisering af nanopartiklerne, eller den kan beskytte nanopartiklerne mod nedbrydning. Da benzylalkohol fungerer som iltkilde og en ligand på samme tid, produceres nøgne nanopartikler uden behov for yderligere overfladeaktive stoffer eller ligands. Nanopartiklerne er derefter let overfladefunktionaliseret efter syntese uden en overfladeaktiv udvekslingsproces.
Heri vurderes to typer nanopartikler, der besidder den samme kerne og adskiller sig i belægningen. Kernen syntetiseres ved hjælp af en hurtig og yderst effektiv mikrobølgebaseret teknik. De to sammenlignede belægninger består af citronsyre, en af de mest anvendte som overfladebehandlingsmiddel i biomedicinske applikationer29,30og polyacrylsyre (PAA), en polymer belægning med et stort antal chelaterende funktioner. VSM magnetometri målinger bruges derefter først til at kvantificere nanopartikel optagelse af cellerne, og derefter som en direkte vurdering af nanopartikel strukturelle integritet ved internalisering i stamceller. Resultaterne viser, at inkubationskoncentrationen påvirker optagelsen af nanopartikler, og at belægningen påvirker deres nedbrydning, idet det store antal forankringsmolekyler i PAA beskytter kernen mod nedbrydning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjælp af en hurtig og effektiv mikrobølgebaseret syntese kan magnetiske nanopartikler let syntetiseres med kontrolleret størrelse og yderligere belagt med givne molekyler. Et kritisk skridt er at lagerføre jernsalt og benzylalkohol under vakuum for at holde en lille spredning i størrelse. Benzylalkoholen fungerer både som opløsningsmiddel og ligand, samtidig med at den gør det muligt direkte at opnå kalibreret bare jernoxid uden behov for yderligere ligands. Efter nanopartikler overførsel i vand de nøgne m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Den Europæiske Union (ERC-2014-CoG-projektet MaTissE #648779). Forfatterne vil gerne anerkende CNanoMat fysisk-kemiske karakteristik platform af University Paris 13.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
Referências
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the “hot-spot” effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al. Biotransformations of magnetic nanoparticles in the body. Nano Today. 11 (3), 280-284 (2016).
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles – The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
