Nåværende metoder for å måle alkoholfølsomhet i Drosophila er designet for å teste grupper av fluer. Vi presenterer en enkel, rimelig, høy gjennomstrømningsanalyse for å vurdere alkoholsedasjonsfølsomhet i et stort antall enkeltfluer. Metoden krever ikke spesialiserte verktøy og kan utføres i et laboratorium ved hjelp av vanlige materialer.
Drosophila melanogaster gir en utmerket modell for å studere den genetiske underbyggelsen av alkoholfølsomhet. I motsetning til studier i menneskelige populasjoner, gir Drosophila-modellen streng kontroll over genetisk bakgrunn, og nesten ubegrenset antall individer av samme genotype kan oppdras raskt under godt kontrollerte miljøforhold uten regulatoriske restriksjoner og til relativt lave kostnader. Fluer utsatt for etanol gjennomgår fysiologiske og atferdsmessige endringer som ligner menneskelig alkoholforgiftning, inkludert tap av postural kontroll, sedasjon og utvikling av toleranse. Her beskriver vi en enkel, rimelig, høy gjennomstrømningsanalyse for å vurdere alkoholsedasjonsfølsomhet i et stort antall enkeltfluer. Analysen er basert på videoopptak av enkeltfluer introdusert uten anestesi i 24-brønncellekulturplater i et oppsett som muliggjør synkron initiering av alkoholeksponering. Systemet gjør det mulig for en enkelt person å samle inn individuelle etanolsedasjonsdata på så mange som 2000 fluer innen en 8-h arbeidsperiode. Analysen kan i prinsippet utvides for å vurdere effekten av eksponering for ethvert flyktig stoff og brukes til å måle effekter av akutt toksisitet av flyktige på andre insekter, inkludert andre fluearter.
National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism rapporterer at i 2015 overdreven alkoholforbruk, utpekt som “alkoholbruk lidelse”, påvirket anslagsvis 16 millioner mennesker i USA. Alkoholmisbruk forårsaker et bredt spekter av negative fysiologiske effekter og er en viktig dødsårsak i USA. Hos mennesker har redusert følsomhet, eller lavt nivå av respons på alkohol, en sterk genetisk komponent og er forbundet med en høyere risiko for å utvikle alkoholbruksforstyrrelser1,2,3,4.4 Genetiske risikostudier på menneskers populasjoner er utfordrende på grunn av befolkningsblanding, ulike utviklingshistorier og miljøeksponeringer, og avhengighet av selvrapporterte spørreskjemaer for å kvantifisere alkoholrelaterte fenotyper, som ofte er forvirret med andre nevropsykiatriske tilstander.
Drosophila melanogaster gir en utmerket modell for å studere den genetiske underbyggelsen av alkoholfølsomhet5,,6,,7,8. Drosophila-modellen gir streng kontroll over genetisk bakgrunn, og nesten ubegrenset antall individer av samme genotype kan oppdras raskt under godt kontrollerte miljøforhold uten regulatoriske restriksjoner og til relativt lave kostnader. I tillegg til offentlig tilgjengelige mutasjoner og RNAi-linjer som retter seg mot et flertall av gener i genomet, har tilgjengeligheten av Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP), en populasjon av 205 innavlede villavledede linjer med komplette genomsekvenser, aktivert genomomfattende foreningsstudier9,10. Slike studier har identifisert genetiske nettverk forbundet med effekter på utviklingstid og levedyktighet ved utviklingseksponering for etanol11,12. Evolusjonær bevaring av grunnleggende biologiske prosesser gjør det mulig å trekke oversettelsesslutninger ved å overliste menneskelige orthologs på sine flykolleger.
Fluer utsatt for etanol gjennomgår fysiologiske og atferdsmessige endringer som ligner menneskelig alkoholforgiftning, inkludert tap av postural kontroll8, sedasjon og utvikling av toleranse13,14,15. Alkohol indusert sedasjon i Drosophila kan kvantifiseres ved hjelp av inebriometre. Dette er 122 cm lange vertikale glasssøyler med skråmaskepartisjoner som fluer kan feste16,,17,18. En gruppe på minst 50 fluer (kjønn kan analyseres separat) innføres i toppen av kolonnen og utsettes for etanoldamp. Fluer som mister postural kontroll faller gjennom kolonnen og samles med 1 min intervaller. Gjennomsnittlig elutiontid tjener som et mål på følsomhet for alkoholforgiftning. Når fluer blir utsatt for alkohol en gang etter å ha kommet seg etter den første eksponeringen, kan de utvikle toleranse, som tydelig fra et skifte i gjennomsnittlig elutiontid13,15,19,20. Mens inebriometer analyser har ført til identifisering av gener, genetiske nettverk og cellulære veier forbundet med alkoholsedasjonsfølsomhet og utvikling av toleranse12,13,14,21, er analysen tidkrevende, lavgjennomstrømning og ineffektiv for måling av alkoholfølsomhet i enkeltfluer.
Alternative etanol sedasjon analyser som ikke krever den forseggjorte inebriometer oppsett tillate for mer praktiske målinger, men er fortsatt begrenset i gjennomstrømning og generelt krever analyser av grupper av fluer i stedet for enkeltpersoner21,22,23,24,25. Vurdering av enkeltfluer minimerer potensialet for forvirrende effekter på grunn av gruppeinteraksjoner, for eksempel de som stammer fra sosial atferd. Her presenterer vi en enkel, rimelig, høy gjennomstrømningsanalyse for å vurdere alkoholsedasjonsfølsomhet i et stort antall enkeltfluer.
Her presenterer vi en enkel, billig og høy gjennomstrømningsmetode for å vurdere sedasjonstid på grunn av etanoleksponering i Drosophila melanogaster. I motsetning til mange nåværende metoder, som krever gruppeanalyser, gjør denne analysen det mulig for en enkelt person å samle inn individuelle sedasjonstidsdata for ~ 2000 fluer innen en 8-timer. Vi fant ut at en enkelt person kan score 48 fluer for sedasjonstid på ca 5 min. Med denne hastigheten kan 2000 fluer scores på ca 4 timer, men scoring kan gjennomføres senere. Med vår analyse varierer den registrerte sedasjonstiden for de fleste fluer fra 5–15 min ved eksponering til 1 ml 100% etanol. Lavere konsentrasjoner av etanol eller mindre leveringsvolumer vil resultere i lengre sedasjonstider.
Gjeldende metoder for å vurdere sedasjonstid krever testing av et stort antall fluer uten lett å aktivere målinger på enkeltpersoner15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Mange nåværende sedasjon og følsomhetanalyser er avhengige av ST5022,23,24, tidspunktet hvor 50% av fluene er bedøvet som følge av etanoleksponering. Selv om det å skaffe ST50 for grupper av fluer ikke var den primære motivasjonen for å utvikle denne analysen, viser videoopptakene høyere verktøy sammenlignet med dagens metoder, da opptakene kan brukes til å fastslå ST50 for grupper av individuelt testede fluer og for å måle prosentandelen av fluer som tilfredsstiller et gitt kriterium (f.eks. tap av postural kontroll) når som helst. Det bør bemerkes at slike videoanalyser ville kreve ekstra tid.
I motsetning til dagens inebriometer analyser, krever metoden vi beskriver ikke spesialiserte verktøy for å sette opp og kan utføres i etlaboratorium ved hjelp av vanlige materialer. Ved hjelp av denne metoden har vi oppnådd pålitelige og konsekvente sedasjonstider for individuelle fluer. Analysen kan i prinsippet utvides for å vurdere effekten av eksponering for ethvert flyktig stoff. Analysen kan også brukes til å måle effekter av akutt toksisitet av flyktige på andre insekter, inkludert andre fluearter. Individuelle sedasjonstidsdata kan brukes til å vurdere omfanget av fenotypisk variasjon i en populasjon, for eksempel DGRP.
Vi brukte lite insektskjermnett for å forhindre direkte kontakt med etanolløsningen, samtidig som tilstrekkelige mengder etanoldamp er tilgjengelig for å nå flyet. Laget av hvit osteklut på toppen av skjermnettet gir visuell kontrast mellom fluen og overflaten under, og sikrer at fluer ikke blir fanget i skjermnettet, noe som kan føre til tvetydig bestemmelse av tap av postural kontroll. Kommersielt tilgjengelige membraner som er porøse for vann og luft ga inkonsekvente resultater og var utilstrekkelig penetrerbare for etanoldamper. Vi brukte med vilje lite insektskjermnett fordi det er et jevnt porøs materiale som minimerer variasjon i etanoleksponering som følge av flyposisjon i en brønn. Modifikasjoner kan gjøres i denne protokollen basert på tilgjengelige materialer, selv om vi anbefaler et kontrollert atferdskammer, tilgang til 90%-100% etanol nær flyet, og ensartet etanoleksponering.
Flyposisjon i cellekulturplatene bør randomiseres mellom replikater for å unngå posisjonsbias. For større eksperimenter som krever bruk av denne analysen over flere dager og derfor er underlagt miljøvariasjon som kan påvirke analyseresultater (f.eks. endringer i barometrisk trykk)27, anbefaler vi sterkt at fluer testes samtidig hver dag og randomiseres både i og på tvers av dager, spesielt hvis ulike linjer og / eller kjønn skal sammenlignes med hverandre.
Metoden vi utviklet er best egnet for måling av effekten av akutt alkoholeksponering, men er ikke egnet for å skaffe forbruksdata eller modelleringsavhengighet. Alkoholsedasjonsfølsomhetsdata hentet fra denne analysen kan imidlertid integreres med andre tiltak for alkoholrelaterte fenotyper. En begrensning av systemet er at den vertikale høyden på standard cellekulturplater gir mulighet for vertikal flybevegelse som ikke lett kan spores av video for detaljert vurdering av generell aktivitet eller bevegelse. Denne begrensningen påvirker imidlertid ikke nøyaktig vurdering av sedasjonstid. Ved bruk av fluer av forskjellige genotyper (f.eks. i DGRP-avledede utavlede populasjoner28),gjør denne analysen også mulig for henting av individuelle fluer å samle bassenger av fluer med kontrasterende fenotyper for bulk DNA sekvensering og ekstrem QTL kartlegging29,30. Samlet sett tillater denne analysen rask, billig innsamling av alkoholsedasjonsdata på et stort antall enkeltfluer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd DA041613 og GM128974 fra National Institutes of Health til TFCM og RRHA.
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |