Los métodos actuales para medir la sensibilidad al alcohol en Drosophila están diseñados para probar grupos de moscas. Presentamos un ensayo simple, de bajo costo y de alto rendimiento para evaluar la sensibilidad a la sedación del alcohol en un gran número de moscas individuales. El método no requiere herramientas especializadas y se puede realizar en cualquier laboratorio utilizando materiales comunes.
Drosophila melanogaster proporciona un excelente modelo para estudiar los fundamentos genéticos de la sensibilidad al alcohol. A diferencia de los estudios en poblaciones humanas, el modelo Drosophila permite un control estricto sobre los antecedentes genéticos, y un número prácticamente ilimitado de individuos del mismo genotipo se puede criar rápidamente bajo condiciones ambientales bien controladas sin restricciones reglamentarias y a un costo relativamente bajo. Las moscas expuestas al etanol sufren cambios fisiológicos y conductuales que se asemejan a la intoxicación por alcohol humano, incluyendo la pérdida del control postural, la sedación y el desarrollo de la tolerancia. Aquí, describimos un ensayo simple, de bajo costo y de alto rendimiento para evaluar la sensibilidad a la sedación del alcohol en un gran número de moscas individuales. El ensayo se basa en la grabación de vídeo de moscas individuales introducidas sin anestesia en placas de cultivo celular de 24 pocillos en una configuración que permite el inicio sincrónico de la exposición al alcohol. El sistema permite a una sola persona recopilar datos individuales de sedación de etanol en hasta 2.000 moscas dentro de un período de trabajo de 8 horas. En principio, el ensayo puede ampliarse para evaluar los efectos de la exposición a cualquier sustancia volátil y aplicarse para medir los efectos de la toxicidad aguda de los volátiles en otros insectos, incluidas otras especies de moscas.
El Instituto Nacional sobre Abuso de Alcohol y Alcoholismo informa que en 2015 el consumo excesivo de alcohol, designado como “trastorno por consumo de alcohol”, afectó a unos 16 millones de personas en los Estados Unidos. El abuso de alcohol causa una amplia gama de efectos fisiológicos adversos y es una de las principales causas de muerte en los Estados Unidos. En los seres humanos, disminución de la sensibilidad, o un bajo nivel de respuesta al alcohol, tiene un fuerte componente genético y se asocia con un mayor riesgo de desarrollar trastornos del consumo de alcohol1,2,3,4. Los estudios de riesgo genético en poblaciones humanas son desafiantes debido a la mezcla de la población, diversos historiales de desarrollo y exposiciones ambientales, y la dependencia de cuestionarios autoinformados para cuantificar fenotipos relacionados con el alcohol, que a menudo se confunden con otras condiciones neuropsiquiátricas.
Drosophila melanogaster proporciona un excelente modelo para estudiar los fundamentos genéticos de la sensibilidad al alcohol5,6,7,8. El modelo Drosophila permite un control estricto sobre los antecedentes genéticos, y un número prácticamente ilimitado de individuos del mismo genotipo se puede criar rápidamente bajo condiciones ambientales bien controladas sin restricciones regulatorias y a un costo relativamente bajo. Además de las mutaciones disponibles públicamente y las líneas de ARNi que se dirigen a la mayoría de los genes en el genoma, la disponibilidad del Panel de Referencia Genética drosophila melanogaster (DGRP), una población de 205 líneas endogámicas derivadas endogámicas con secuencias completas del genoma, ha permitido estudios de asociación en todo el genoma9,,10. Dichos estudios han identificado redes genéticas asociadas con los efectos sobre el tiempo de desarrollo y la viabilidad en la exposición al desarrollo al etanol11,12. La conservación evolutiva de los procesos biológicos fundamentales permite extraer inferencias traslacionales mediante la superposición de ortologs humanos en sus contrapartes de mosca.
Las moscas expuestas al etanol sufren cambios fisiológicos y conductuales que se asemejan a la intoxicación por alcohol humano, incluyendo la pérdida del control postural8,la sedación y el desarrollo de la tolerancia13,,14,,15. La sedación inducida por alcohol en Drosophila se puede cuantificar utilizando inebriómetros. Se trata de columnas de vidrio vertical de 122 cm de largo con tabiques de malla eslanados a los que las moscas pueden unir16,,17,,18. Un grupo de al menos 50 moscas (los sexos se pueden analizar por separado) se introducen en la parte superior de la columna y se exponen a vapores de etanol. Las moscas que pierden el control postural caen a través de la columna y se recogen a intervalos de 1 minuto. El tiempo medio de elución sirve como una medida de sensibilidad a la intoxicación por alcohol. Cuando las moscas se exponen al alcohol por segunda vez después de recuperarse de la primera exposición, pueden desarrollar tolerancia, como se desprende de un cambio en el tiempo medio de elución13,15,19,20. Mientras que los ensayos de embriabolímetros han llevado a la identificación de genes, redes genéticas y vías celulares asociadas con la sensibilidad a la sedación alcohólica y el desarrollo de tolerancia12,,13,,14,21, el ensayo consume mucho tiempo, bajo rendimiento e ineficaz para medir la sensibilidad al alcohol en moscas individuales.
Los ensayos alternativos de sedación de etanol que no requieren la elaborada configuración del ebriómetro permiten mediciones más convenientes pero siguen siendo limitados en el rendimiento y generalmente requieren análisis de grupos de moscas en lugar de individuos21,,22,,23,,24,,25. La evaluación de moscas individuales minimiza el potencial de efectos de confunción debido a interacciones grupales, como las derivadas de comportamientos sociales. Aquí, presentamos un ensayo simple, de bajo costo y de alto rendimiento para evaluar la sensibilidad a la sedación del alcohol en un gran número de moscas individuales.
Aquí, presentamos un método simple, económico y de alto rendimiento para evaluar el tiempo de sedación debido a la exposición al etanol en Drosophila melanogaster. A diferencia de muchos métodos actuales, que requieren análisis de grupo, este ensayo permite a una sola persona recopilar datos de tiempo de sedación individual para 2.000 moscas dentro de un período de trabajo de 8 horas. Encontramos que una sola persona puede anotar 48 moscas para el tiempo de sedación en aproximadamente 5 min. A este ritmo, 2.000 moscas se pueden puntuar en aproximadamente 4 h, aunque la puntuación se puede llevar a cabo más adelante. Con nuestro ensayo, el tiempo de sedación registrado para la mayoría de las moscas oscila entre 5-15 minutos a una exposición a 1 ml de etanol 100%. Las concentraciones más bajas de etanol o los volúmenes de entrega más pequeños darán lugar a tiempos de sedación más largos.
Los métodos actuales para evaluar el tiempo de sedación requieren probar un gran número de moscas sin permitir fácilmente mediciones en individuos individuales15,,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Muchos ensayos actuales de sedación y sensibilidad dependen de ST5022,,23,24, el punto de tiempo en el que el 50% de las moscas se sedan como resultado de la exposición al etanol. Aunque la obtención del ST50 para grupos de moscas no fue la principal motivación para desarrollar este ensayo, las grabaciones de vídeo demuestran una mayor utilidad en comparación con los métodos actuales, ya que las grabaciones se pueden utilizar para determinar el ST50 para grupos de moscas probadas individualmente y para medir el porcentaje de moscas que satisfacen un criterio determinado (por ejemplo, pérdida de control postural) en cualquier momento. Cabe señalar que tales análisis de vídeo requerirían tiempo adicional.
A diferencia de los ensayos de inebriómetro actuales, el método que describimos no requiere herramientas especializadas para configurar y se puede realizar en cualquier laboratorio utilizando materiales comunes. Usando este método, hemos obtenido tiempos de sedación confiables y consistentes para moscas individuales. En principio, el ensayo puede ampliarse para evaluar los efectos de la exposición a cualquier sustancia volátil. El ensayo también se puede aplicar para medir los efectos de la toxicidad aguda de los volátiles en otros insectos, incluidas otras especies de moscas. Los datos de tiempo de sedación individual es para evaluar el grado de variación fenotípica dentro de una población, como la DGRP.
Utilizamos pequeñas mallas de pantalla de insectos para evitar el contacto directo con la solución de etanol, al tiempo que permitimos que cantidades adecuadas de vapores de etanol lleguen a la mosca. La capa de tela de queso blanco en la parte superior de la malla de la pantalla proporciona contraste visual entre la mosca y la superficie de abajo y asegura que las moscas no queden atrapadas en la malla de la pantalla, lo que podría conducir a una determinación ambigua de la pérdida del control postural. Las membranas disponibles comercialmente que son porosas para el agua y el aire dieron resultados inconsistentes y eran insuficientemente penetrables a los vapores de etanol. Usamos intencionalmente una pequeña malla de pantalla de insectos porque es un material uniformemente poroso que minimiza la variación en la exposición al etanol como resultado de la posición de la mosca dentro de un pozo. Se pueden hacer modificaciones en este protocolo sobre la base de los materiales disponibles, aunque recomendamos una cámara de comportamiento controlada, acceso a etanol del 90% al 100% cerca de la mosca y una exposición uniforme al etanol.
La posición de la mosca dentro de las placas de cultivo celular debe ser aleatoria entre réplicas para evitar el sesgo posicional. Para experimentos más grandes que requieren el uso de este ensayo a lo largo de varios días y por lo tanto están sujetos a variaciones ambientales que podrían influir en los resultados del ensayo (por ejemplo, cambios en la presión barométrica)27,recomendamos encarecidamente que las moscas se prueben a la misma hora cada día y se aletimen tanto dentro como a lo largo de los días, especialmente si se deben comparar diferentes líneas y/o sexos entre sí.
El método que desarrollamos es el más adecuado para medir el efecto de la exposición aguda al alcohol, pero no es adecuado para obtener datos de consumo o modelar la adicción. Sin embargo, los datos de sensibilidad a la sedación alcohólica obtenidos de este ensayo pueden integrarse con otras medidas de fenotipos relacionados con el alcohol. Una limitación del sistema es que la altura vertical de las placas de cultivo celular estándar permite el movimiento de la mosca vertical que no se puede rastrear fácilmente por vídeo para una evaluación detallada de la actividad general o la locomoción. Sin embargo, esta limitación no afecta a la evaluación precisa del tiempo de sedación. Cuando se utilizan moscas de diferentes genotipos (por ejemplo, en poblaciones de razas derivadas de LA DGRP28), este ensayo también permite la recuperación de moscas individuales para recoger piscinas de moscas con fenotipos en contraste para la secuenciación de ADN a granel y mapeo QTL extremo29,,30. En general, este ensayo permite una recopilación rápida y barata de datos de sedación alcohólica en un gran número de moscas individuales.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones DA041613 y GM128974 de los Institutos Nacionales de Salud a TFCM y RRHA.
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |