Her presenterer vi en detaljert protokoll for å studere nevronal α-synuclein akkumulering i primære mus dopamin nevroner. Fosforylert α-synuclein aggregater i nevroner induseres med pre-formet α-synuclein fibriller. Automatisert avbildning av immunfluorescerende merkede celler og objektiv bildeanalyse gjør denne robuste protokollen egnet for middels til høy gjennomstrømningsscreening av legemidler som hemmer α-synuclein akkumulering.
Målet med denne protokollen er å etablere en robust og reproduserbar modell av α-synuclein akkumulering i primære dopamin nevroner. Kombinert med immunostaining og objektiv automatisert bildeanalyse, gjør denne modellen det mulig å analysere effekten av narkotika og genetiske manipulasjoner på α-synuclein aggregering i nevronale kulturer. Primære midbrain kulturer gir en pålitelig kilde til bona fide embryonale dopamin nevroner. I denne protokollen, kjennetegnet histopathology av Parkinsons sykdom, Lewy organer (LB), etterlignes av tillegg av α-synuclein pre-formet fibrils (PFFs) direkte til nevronale kultur medier. Akkumulering av endogene fosforylert α-synuclein i soma av dopaminnevroner oppdages ved immunos oppnåelse allerede på 7 dager etter PFF-tillegget. In vitro cellekultur forhold er også egnet for anvendelse og evaluering av behandlinger som hindrer α-synuclein akkumulering, som små molekyl medisiner og nevrotrofiske faktorer, samt lentivirus vektorer for genetisk manipulasjon (f.eks med CRISPR / Cas9). Å ulturre nevronene i 96 brønnplater øker robustheten og kraften i de eksperimentelle oppsettene. På slutten av forsøket er cellene festet med paraformaldehyd for immunocytokjemi og fluorescensmikroskopi. Multispektrale fluorescensbilder oppnås via automatisert mikroskopi av 96 brønnplater. Disse dataene kvantifiseres (f.eks. teller antall fosfor-α-synucleinholdige dopaminnevroner per brønn) med bruk av fri programvare som gir en plattform for objektiv fenotypeanalyse med høyt innhold. PFF-indusert modellering av fosforolert α-synuclein akkumulering i primære dopamin nevroner gir et pålitelig verktøy for å studere de underliggende mekanismene mediere dannelse og eliminering av α-synuclein inneslutninger, med mulighet for høy gjennomstrømning narkotika screening og cellulær fenotype analyse.
Parkinsons sykdom (PD) er en nevrodegenerativ lidelse preget av død av midbrain dopamin nevroner i substantia nigra (SN), påfølgende tap av dopamin tone i basal ganglia, og påfølgende motoriske funksjonsnedsettelser1,2. En stor histoppathological funksjon i hjernen til PD pasienter er intracellulære protein / lipid aggregater funnet i nevronal soma, kalt Lewy organer (LB), eller i neurites, Lewy neurites (LN), kollektivt kjent som Lewy patologi3. Lewy patologi i hjernen ser ut til å utvikle seg med å fremme PD som ligner spredningen av patogene faktorer gjennom nevronale forbindelser. Rikelig Lewy patologi finnes i dopamin nevroner i SN og celler i andre områder som er berørt av nevrodegenerasjon4. Men under sykdomsprogresjon, spredning og utbruddet av proteinaggregasjon ikke alltid korrelerer med nevronal død og det nøyaktige bidraget av Lewy patologi til nevronal død er fortsatt uklart5.
LB og LN hadde vist seg å bestå av membranøse og proteinholdige komponenter3. Den tidligere er membran fragmenter, vesikulære strukturer (muligens lysosomer og autophagosomer) og mitokondrier3. Sistnevnte består av minst 300 forskjellige proteiner6. En kjennetegnstudie av Spillantini et al.7 viste at den viktigste proteinkomponenten i Lewy patologi er α-synuclein. Svært uttrykt i nevroner, og knyttet til membranfusjon og nevrotransmitter utgivelse, α-synuclein i Lewy patologi er til stede hovedsakelig i misfolded, amyloid fibril form, hvorav hoveddelen er fosforylert på Ser129 (pS129-αsyn)4,8.
Viktigere, det ble også vist at på grunn av sin prion-lignende egenskaper, feilfoldet α-synuclein kan ha en årsakssammenheng rolle i Lewy patologiformasjon 4. De prionlignende egenskapene til feilfoldet α-synuclein ble vist med både midbrainekstrakter fra pasienter og eksogent forberedt α-synuclein preformed fibriller (PFFs) for å indusere α-synuclein aggregater i nevroner i kultur og in vivo9,10. PFFs presenterer en pålitelig og robust modell for å studere utviklingen av α-synuclein patologi i dopaminnevroner. Når PFFs brukes på kultiverte primære nevroner eller injiseres i dyrehjernen, fører de til dannelsen av α-synuclein-inneholdende inneslutninger i neurites og cellesoma11 som rekapitulerer mange funksjoner sett i Lewy patologi. Observerte inneslutninger er vaskemiddel-uoppløselige i Triton X, ubiquitinated, farget med amyloid spesifikk fargestoff Thioflavin S, og inneholder α-synuclein hyperphosphorylated på Ser12911,12. Viktigere, disse inneslutningene ikke dannes i α-synuclein knockout dyr11, noe som indikerer avhengigheten av deres dannelse på endogene α-synuclein.
Likevel er det vanskelig å direkte sammenligne PFF-induserte inneslutninger og Lewy patologi funnet i PD-pasienter fordi menneskelige LBer og LNs er svært heterogene3. Observert heterogenitet av Lewy patologi kan være forårsaket av ulike stadier av formasjonen, forskjellig anatomisk plassering, eller forskjeller i konformasjonen av feilbrettet α-synuclein initiere aggregeringsprosessen. De samme faktorene kan påvirke PFF-induserte pS129-αsyn positive inneslutninger. Faktisk ble det nylig vist at PFF-indusert pS129-αsyn positive inneslutninger i primære nevronale kulturer representerer svært tidlige stadier av patologi som kan modnes til strukturer som ligner LB tett etter langvarig inkubasjonsperiode12,13.
Modellering tidlig spredning og akkumulering av feilbrettet α-synuclein med PFFs er verdifull for narkotikautvikling, da Lewy patologi spredning regnes som en av de tidlige sykdomsmarkørene. Derfor kan aggregeringsforebyggende behandlinger være lovende for å stoppe eller bremse utviklingen av PD i svært tidlige stadier. Flere kliniske studier som tar sikte på å bremse eller stoppe α-synuclein akkumulering pågår14. For senere stadium pasienter, transplantasjon av dopamin nevronale stamfar kan være et bedre behandlingsalternativ15. Imidlertid ble Lewy patologi dokumentert i transplanterte embryonale nevroner under post-mortem analyse av PD pasient hjerner16,17, også indikerer behovet for beskyttelse mot α-synuclein akkumulering.
In vitro, α-synuclein PFFs er kjent for å indusere aggregering i udødeliggjorte cellelinjer, eller oftere, i gnager primære hippocampal eller kortikale nevroner. Ingen av disse er i nærheten av rekapitulerende dopaminnevroner10. Culturing disse nevronene krever tett plating av visse antall nevroner in vitro18. For å oppnå høy plating tetthet med begrenset materiale (f.eks primære dopamin nevroner), mikro øya kulturing metoden er ofte utnyttet. I mikro øykultering, celler er opprinnelig belagt i en liten dråpe medium (vanligvis noen mikroliters) holdt sammen av overflatespenning i midten av en storbrønn 18. Etter at nevronene festes, er hele brønnen fylt med mediet mens cellene forblir begrenset ved høy tetthet i det lille platingområdet. I tillegg til å oppnå høy plating tetthet, mikro øyer også hindre plating nær kantene av brønner, hvor variasjoner i celletetthet og overlevelse er hyppige. Mikroøyer brukes ofte i relativt store brønner eller retter; Men å etablere midbrain nevronale kulturer i mikroøyer i 96 brønnplateformat gjør det mulig å studere Lewy patologi i bona fide dopamin nevroner med middels til høy gjennomstrømningskraft. In vitro eksperimenter med disse nevronene tillot oss å oppdage glial celle linje-avledet nevrotrofisk faktor (GDNF), som fremmer overlevelse av modne dopamin nevroner in vitro og in vivo19,20,21,22 og også forhindrer dannelsen av α-synuclein aggregater i dopamin nevroner23. Human pasient-indusert pluripotent stamcelle-avledede dopamin nevroner utgjør en mer nøyaktig modell på grunn av deres menneskelige opprinnelse og lengre overlevelsestid in vitro. Induksjon av α-synucleinpatologi hos humane nevroner observeres imidlertid etter flere måneder, sammenlignet med en uke i mus embryonale nevroner, og/eller med flere stressfaktorer (f.eks. kombinasjon av α-synuclein overuttrykk og PFFs)24,25. I tillegg er vedlikehold av humane dopaminnevroner dyrere og arbeidskrevende sammenlignet med primære embryonale nevroner, som i hovedsak begrenser bruken i høygjennomstrømningsapplikasjoner.
Videre kan primære dopamin nevronale kulturer genmodifiseres (f.eks. med CRISPR/Cas9) og/eller behandles med farmakologiske midler23. De utgjør en rask og reproduserbar plattform for applikasjoner som molekylær veidisseksjon og narkotikabibliotekscreening. Selv om begrenset materiale kan fås fra disse kulturene, er det fortsatt mulig å gjennomføre mikroomikkanalyser i liten størrelse. Culturing primære nevroner i 96 brønnformat er bedre for immunocytokjemi og fluorescens mikroskopi teknikker, etterfulgt av høyinnholds fenotype analyse. Multispektralfluorescensbilder avledet fra automatisert avbildning av 96 brønnplater kan konverteres til kvantitative resultater (f.eks. antall LB-inneholdende nevroner per brønn). Slike analyser kan gjøres med fri programvare, for eksempel CellProfiler26,27. Samlet sett gir primære embryonale midbrainkulturer belagt med 96 brønnplater en robust og effektiv plattform for å studere dopaminnevroner og α-synuclein aggregering med mulighet for høy gjennomstrømning fenotype screening.
Spredning av Lewy patologi, hvorav pS129-αsyn er en stor bestanddel, er et histopodoologisk kjennetegn på PD. Stoppe eller bremse akkumuleringen av aggregert pS129-αsyn kan bremse degenerasjonen av dopaminnevroner og utviklingen av alfa-synucleinopati. Imidlertid bidrar en mekanistisk forståelse av hvordan pS129-αsyn aggregering til bortfallet av dopaminnevroner fortsatt må etableres. Bevis fra menneskelige postmortem studier på hjerneprøver fra pasienter på ulike stadier av sykdommen samt observasjon av pS129-αsyn positiv inkludering i transplanterte fosternevroner sterkt antyder spredning av Lewy patologi mellom celler16,17,33. Følgelig ble prionlignende spredning av pS129-αsyn nylig rekapitulert ved hjelp av α-synuclein PFFs9,10. Etablering av en robust, kostnadseffektiv og relativt høy eller middels gjennomstrømning modell av pS129-αsyn spredning og akkumulering, spesielt i dopamin nevroner, kan betydelig fremskynde søket etter nye behandlinger og forbindelser endre denne prosessen.
Fordi tap av dopamin nevroner er hovedårsaken til motoriske symptomer i PD og disse cellene har mange unike egenskaper2,34,35, modellering av prion-lignende spredning av pS129-αsyn i dopamin nevroner er den mest relevante typen modell fra det translasjonære perspektivet. Protokoller ved hjelp av mikroøykulturer av embryonale midbrain nevroner på 4 brønnplater og halvautomatisk kvantifisering har blitt beskrevet tidligere18. Protokollen som er beskrevet her ble tilpasset 96 brønnplater og gir mindre arbeidskrevende forberedelse av mikroøyer, noe som åpner for fremstilling av opptil fire plater som inneholder 60 brønner hver av en erfaren forsker i løpet av en arbeidsdag. Culturing dopamin nevroner i 96 brønnplater gjør det mulig for testing av narkotika ved lavere mengder og muliggjør høye transduksjonsrater med lentivirus vektorer. Det er også mulig å kombinere ulike behandlinger for å utføre mer komplekse eksperimenter.
Før du bruker noen behandlinger (inkludert PFFs), bør kvaliteten på kulturingen kontrolleres med lysfeltmikroskopi. Hvis mikroskopisystemet ikke bruker et CO2-kammer med oppvarming, bør cellene ikke holdes utenfor inkubatoren i mer enn par minutter, fordi primære musee dopaminnevroner er delikate og lett stresset. Av samme grunn anbefales det at den første avbildningen skal gjøres etter 24 t inkubasjon (mellom DIV1-DIV3). Cellene skal synes å være i live med nåværende cellelegemer og homogent spredt inne på mikroøya. Primære nevroner ville ha slått seg ned på po-belagt bakken og begynte å etablere nevronale projeksjoner. Det er mulig å observere små klumper av celler (dvs. diameter mindre enn 150-200 μm) som kan dannes hvis triturasjonsprosessen ikke er gjort riktig eller plating tetthet er høyere enn anbefalt. Disse små klumpene ville ikke påvirke eksperimentet, med mindre de er mer enn noen få per brønn og / eller større. Klumpede celler gjør det svært vanskelig å identifisere immunohistokjemiske markører og individuelle celler under bildeanalysen. Det er viktig å unngå slike klumper ved forsiktig belegg, triturating, og kontrollere plating tetthet. Hvis ensartetheten av disse forholdene ikke kan observeres ved visse brønner, må du ikke inkludere disse defekte brønnene i forsøket. Slik utelukkelse bør gjøres før gjennomføring av noen behandlinger.
Videre gir utnyttelse av 96 brønnplater praktisk flerkanals pipettebruk under fargingsprosedyrer og direkte visualisering med automatiske platemikroskoper, noe som øker gjennomstrømningen ytterligere. Utnyttelse av automatisert bildekvantifisering er uunnværlig for analysen av dataene fra bildeplattformer med høyt innhold. I tillegg til evnen til å behandle tusenvis av bilder hentet fra hvert eksperiment, sikrer det objektiv, identisk kvantifisering av alle behandlingsgrupper. Arbeidsflyten foreslått for bildeanalysen er basert på enkle prinsipper for segmentering av dopaminnevroner, filtrering riktig segmenterte celler ved tilsyn maskinlæring, og deretter kvantifisering av fenotyper (pS129-αsyn positiv og pS129-synα negativ), igjen ved tilsyn maskinlæring. Selv om flere forskjellige tilnærminger for denne oppgaven kan forestilles, har vi funnet kombinasjonen av segmentering med maskinlæring for å være den mest robuste for dopaminkulturer på grunn av høy plating tetthet, de ulike formene av dopamin nevroner, og tilstedeværelsen av sterkt farget neurites. Den foreslåtte bildeanalysealgoritmen ble implementert i CellProfiler og CellProfiler Analyst, åpen kildekode, fritt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare med høyt innhold26,27. Algoritmen kan også implementeres med annen bildeanalyseprogramvare, enten åpen kildekode (f.eks. ImageJ/FIJI, KNIME) eller proprietær. Men etter vår erfaring ofrer disse ofte tilpasningsevner for brukervennlighet, og kan derfor ikke fungere godt i kompliserte analyser. Vi har funnet ut at cellprofiler- og cellprofileranalytikerprogramvarepakkene gir spesielt pålitelige resultater ved å kombinere et betydelig antall implementerte algoritmer, ekstrem fleksibilitet i utformingen av arbeidsflyten og samtidig håndtere og effektivt behandle data med høyinnhold.
Den beskrevne protokollen kan også tilpasses for kvantifisering av andre cellulære fenotyper preget av immunostaining med forskjellige antistoffer, som markører for andre nevronale populasjoner (f.eks. DAT, GAD67, 5-HT osv.) og proteinaggregater (f.eks. fospo-Tau, ubiquitin). Flere fluorescerende markører kan også kombineres for å skille mellom flere fenotyper (f.eks. celler med inneslutninger på ulike stadier av modning). Automatisert klassifisering av flere fenotyper bør også være lett å implementere i de beskrevne bildeanalyserørledningene ved bare å legge til en kanal som inneholder immunfluorescerende bilder av flere markører til måletrinn og sortering av celler i flere hyller. Utnyttelse av flere markører samtidig ville imidlertid kreve optimalisering av immunostaining og bildebehandlingsforhold. I tillegg, for bedre kvalitet i immunfluorescensavbildning, anbefales bruk av spesielle svartveggede 96 brønnplater eksplisitt designet for det fluorescerende mikroskopet. Disse kan imidlertid være betydelig dyrere enn standard cellekulturplater, som er tilstrekkelige for analysen som er beskrevet i vår protokoll.
Typen og kvaliteten på de benyttede PFFs er avgjørende for utfallet av eksperimentene. PFFs kan både påvirke analysens robusthet og tolkning av resultatene. Forberedelsesforhold kan påvirke såingseffektiviteten til PFFs og faktisk PFF “stammer” med forskjellige fysiologiske egenskaper har blitt rapportert36. Likevel er forberedelse og validering av PFFs utenfor omfanget av denne artikkelen og har blitt beskrevet i flere publikasjoner11,28,29,30. I tillegg til preparatprotokollen bør arten av opprinnelse av α-synuclein i PFFs (f.eks, mus, menneske) og bruk av villtype eller mutert protein (f.eks. humant A53T α-synuclein) vurderes, avhengig av de spesielle eksperimentelle forholdene. Induksjon av pS129-αsyn akkumulering av PFFs ble vist å være avhengig av alder av kulturen (dvs. dager in vitro), med mer modne kulturer som viser mer uttalt induksjon11. Dette skyldes sannsynligvis det økte antallet nevronale forbindelser i mer modne kulturer, og økte α-synuclein proteinnivåer. I våre hender ga behandling med PFFs ved DIV8 de mest robuste resultatene, med uttalt akkumulering av pS129-αsyn i dopaminnevron soma, mens det ikke gikk på akkord med nevronal overlevelse. Den beskrevne protokollen er godt egnet til å studere behandlinger som endrer tidlige hendelser som fører til aggregering av endogene α-synuclein fordi vi kvantifiserer pS129-αsyn positive inneslutninger på et relativt tidlig tidspunkt, 7 dager etter inokulasjon med PFFs. På dette tidspunktet er intrasomale inneslutninger tilstede i en betydelig brøkdel av celler og kan lett skilles ved immunostaining mens ingen PFF-indusert celledød observeres, noe som forenkler tolkningen av resultatene. Viktigere, som morfologi og sammensetning av PFF-induserte inneslutninger kan endres over tid12,13, den beskrevne protokollen kan i prinsippet endres for å studere mer modne inneslutninger ved fiksering og immunos oppnåelse på senere tidspunkter. Men å holde dopaminnevroner i kulturen i mer enn 15 dager krever ekstrem omsorg, og kan indusere ytterligere variasjon på grunn av celler som ikke overlever uavhengig av PFF-inokulasjon. I tillegg kompliserer mer utvidede kulturer behandlingsplaner. Mange forbindelser har begrenset eller ikke dårlig preget stabilitet i cellekulturmediet, og etterfylling av et stoff er ikke trivielt fordi fullstendig utveksling av middels kompromisser overlevelsen av dopaminkulturene.
Fosforylering av α-synuclein ved Ser129 rapporteres konsekvent i PFF-baserte modeller av α-synuclein aggregering og kolokalizes med markører for feilfolding og aggregering som Thioflavin S, ubiquitin eller konformasjonsspesifikke antistoffer11,,12. I våre hender gir immunostaining for pS129-αsyn også det sterkeste signalet med lavest bakgrunn og er mest grei å analysere, noe som gir robuste resultater når flere behandlinger screenes. Viktigere, immunos taining med pS129-αsyn antistoff oppdager ikke PFFs som forblir utenfor cellene, noe som reduserer bakgrunnen betydelig. Det er imidlertid viktig å huske at Ser129 fosforylering sannsynligvis er en av de tidligste prosessene knyttet til feilfolding av α-synuclein og kan være forskjellig regulert under bestemte forhold. Eventuelle funn som viser positive effekter på pS129-αsyn, bør derfor bekreftes av andre markører.
Statistisk analyse bør skreddersys tilsvarende til eksperimentell design. Det er viktig å utføre eksperimenter i minst tre uavhengige biologiske replikeringer (dvs. separate primære nevronale kulturer). Disse replikene skal belagt på forskjellige plater og behandles uavhengig. Vi analyserer dataene som er hentet fra replikere på forskjellige plater med tilfeldig blokkdesign ANOVA37 for å ta hensyn til sammenkobling av data for ulike eksperimentelle plater.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker prof. Kelvin Luk for hans sjenerøse gave av α-synuclein PFFs, Conjung Zheng for å etablere og kultinere nevronale celler, og Light Microscopy Unit ved Institutt for bioteknologi, Universitetet i Helsinki, for avbildningsimmuniserte celler. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra 3i-Regeneration av Business Finland (Finnish Funding Agency for Innovation), Academy of Finland #309489, #293392, #319195; Sigrid Juselius Foundation, og de lovbestemte midlene til Maj Institute of Pharmacology, PAS, Polen.
0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
rabbit monoclonal anti-phospha-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |