Mus fotpad inokulering modell för att studera viral-inducerad Neuroinflammatoriska svar
Summary
Footpad inokulering modellen är ett värdefullt verktyg för att karakterisera viral-inducerad neuroinflammatoriska svar in vivo. I synnerhet ger det en tydlig bedömning av viral kinetik och tillhörande immunopatologiska processer som inletts i det perifera nervsystemet.
Abstract
Detta protokoll beskriver en footpad inokulering modell som används för att studera inledande och utveckling av neuroinflammatory svar under alphaherpesvirus infektion hos möss. Eftersom alphaherpesviruses är huvudsakliga inkräktare av det perifera nervsystemet (PNS), är denna modell lämplig att karakterisera kinetiken av viral replikering, dess spridning från PNS till CNS och tillhörande neuroinflammatoriska svar. Footpad inympning modellen tillåter viruspartiklar att sprida sig från en primär infektion plats i footpad epidermis till sensoriska och sympatiska nervfibrer som innervera epidermis, svettkörtlar, och dermis. Infektionen sprider sig via ischiasnerven till dorsala rot ganglierna (DRG) och i slutändan genom ryggmärgen till hjärnan. Här är en mus fotplatta inokuleras med pseudorabies virus (PRV), en alphaherpesvirus nära besläktad med herpes simplex virus (HSV) och varicella-zoster virus (VZV). Denna modell visar att PRV-infektion inducerar svår inflammation, som kännetecknas av neutrofilinfiltration i fotplattan och DRG. Höga koncentrationer av inflammatoriska cytokiner upptäcks därefter i homogeniserade vävnader av ELISA. Dessutom observeras en stark korrelation mellan PRV gen och protein uttryck (via qPCR och OM färgning) i DRG och produktion av proinflammatoriska cytokiner. Därför ger footpad inympning modellen en bättre förståelse av de processer som ligger bakom alphaherpesvirus-inducerad neuropatier och kan leda till utveckling av innovativa terapeutiska strategier. Dessutom kan modellen vägleda forskning om perifera neuropatier, såsom multipel skleros och tillhörande viral-inducerad skada på PNS. I slutändan, Det kan fungera som ett kostnadseffektivt in vivo verktyg för läkemedelsutveckling.
Introduction
Denna studie beskriver en footpad inokulering modell för att undersöka replikering och spridning av virus från PNS till CNS och tillhörande neuroinflammatory svar. Footpad inokulering modellen har intensivt använts för att studera alphaherpesvirus infektion i nervceller1,2,3. Huvudsyftet med denna modell är att tillåta neurotropa virus att resa ett maximalt avstånd genom PNS innan de når CNS. Här används denna modell för att få nya insikter i utvecklingen av en viss neuropati (neuropatisk klåda) hos möss infekterade med pseudorabiesvirus (PRV).
PRV är ett alfaherpesvirus relaterat till flera välkända patogener (dvs. herpes simplex typ 1 och 2 [HSV1 och HSV2] och varicella-zoster virus [VZV]), som orsakar munsår, genitala lesioner, och vattkoppor,respektive 4. Dessa virus är alla pantropiska och kunna infektera många olika celltyper utan att visa affinitet för en viss vävnadstyp. De uppvisar dock alla en karakteristisk neurotropism genom att invadera PNS (och ibland CNS) av värdarter. Den naturliga värden är grisen, men PRV kan infektera de flesta däggdjur. I dessa icke-naturliga värdar infekterar PRV PNS och inducerar en allvarlig klåda som kallas “galna kliar”, följt av perakut död5,6. Rollen av neuroimmune svar i det kliniska resultatet och patogenes av PRV infektion har varit dåligt förstått.
Footpad inokulering modellen tillåter PRV att initiera infektion i epidermala cellerna i fotplattan. Sedan sprider infektionen till sensoriska och sympatiska nervfibrer som innerverar epidermis, svettkörtlar och dermis. Infektionen sprids genom viruspartiklar som rör sig via ischiasnerven till DRG inom cirka 60 timmar. Infektionen sprider sig genom ryggmärgen, slutligen når hindbrain när djur blir döende (82 h efter infektion). Under denna tidsperiod kan vävnadsprover samlas in, bearbetas och analyseras för virusreplikation och markörer för immunsvaret. Till exempel kan histologisk undersökning och viral belastning kvantifiering utföras i olika vävnader för att fastställa korrelationer mellan inledande och utveckling av kliniska, virological och neuroinflammatoriska processer i PRV patogenes.
Med hjälp av footpad inokulering modell, cellulära och molekylära mekanismer prv-inducerad klåda hos möss kan undersökas. Dessutom kan denna modell ge ny insikt i initiering och utveckling av virus-inducerad neuroinflammation under herpesvirus infektioner. En bättre förståelse av de processer som ligger bakom alphaherpesvirus-inducerad neuropatier kan leda till utveckling av innovativa terapeutiska strategier. Till exempel är denna modell användbar för att undersöka mekanismerna för neuropatisk klåda hos patienter med postherpetiska lesioner (t.ex. herpes zoster, bältros) och testa nya terapeutiska mål hos möss för motsvarande mänskliga sjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Footpad inokulering modell som beskrivs här är användbart för att undersöka inledandet och utvecklingen av neuroinflammatory svar under alphaherpesvirus infektion. Dessutom används denna in vivo-modell för att fastställa kinetiken för replikering och spridning av alphaherpesvirus från PNS till CNS. Detta är en alternativ till andra inokulering modeller, såsom flanken huden inympning modell, som bygger på djup dermal repor13, eller intrakraniell väg, som direkt introducerar viruset i …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Charles River laboratorier för deras utmärkta tekniska stöd utför histopathology analyser. Detta arbete finansierades av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 och RO1 NS060699). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
Referências
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Aujeszky’s disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).
- Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. . Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer’s Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
