Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)
Summary
A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.
Abstract
A identificação de interações proteicas e DNA específicas no genoma é importante para entender a regulação genética. A imunoprecipitação de cromatina juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) é amplamente usada para identificar locais de ligação em todo o genoma de proteínas de ligação de DNA. No entanto, o método ChIP-seq é limitado por sua heterogeneidade no comprimento de fragmentos de DNA sonicados e DNA de fundo não específico, resultando em baixa resolução de mapeamento e incerteza em locais de ligação de DNA. Para superar essas limitações, a combinação de ChIP com digestão exonuclease (ChIP-exo) utiliza a digestão exonuclease de 5′ a 3′ para aparar o DNA imunoprecipitado heterogêneo ao local de ligação cruzada proteína-DNA. O tratamento de exonuclease também elimina dna de fundo não específico. O DNA preparado pela biblioteca e exonuclease pode ser enviado para sequenciamento de alto rendimento. O método ChIP-exo permite uma resolução de mapeamento de par de base próxima com maior sensibilidade à detecção e sinal de fundo reduzido. Um protocolo ChIP-exo otimizado para células mamíferas e sequenciamento de próxima geração é descrito abaixo.
Introduction
Os locais das interações proteína-DNA fornecem uma visão dos mecanismos de regulação genética. A imunoprecipitação de cromatina juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) tem sido usada há uma década para examinar interações genoma-DNA em células vivas1,2. No entanto, o método ChIP-seq é limitado pela heterogeneidade na fragmentação do DNA e contaminação de DNA desvinculada que leva a baixa resolução de mapeamento, falsos positivos, chamadas perdidas e sinal de fundo não específico. A combinação de ChIP com digestão exonuclease (ChIP-exo) melhora o método ChIP-seq, aparando o DNA ChIP aos pontos de cruzamento de DNA proteico, fornecendo resolução próxima do par de base e um sinal de fundo baixo3,4,5. A resolução de mapeamento muito melhorada e o baixo fundo fornecido pelo ChIP-exo permitem que locais precisos e abrangentes de ligação proteína-DNA sejam determinados em todo o genoma. O ChIP-exo é capaz de revelar motivos de ligação de DNA funcionalmente distintos, interações cooperativas entre fatores de transcrição (TF) e múltiplos locais de ligação entre proteínas e DNA em um determinado local de ligação genômica, não detectável por outros métodos de mapeamento genômico3,4,6,7.
ChIP-exo foi inicialmente usado em levedura brotante para examinar a vinculação de DNA específica de sequência de TFs, para estudar a organização precisa do complexo de pré-iniciação da transcrição, e estrutura subnucleosômica de histones individuais através do genoma4,8,9. Desde sua introdução em 20114, o ChIP-exo tem sido utilizado com sucesso em muitos outros organismos, incluindo bactérias, camundongos e células humanas7,10,11,12,13,14,15,16,17. Em 2016, Rhee et al.14 usaram ChIP-exo em neurônios mamíferos pela primeira vez para entender como a expressão genética neuronal foi mantida após a baixa regulação da programação TF Lhx3, que forma um complexo heterodimer com outra programação TF Isl1. Este estudo mostrou que, na ausência de Lhx3, o Isl1 é recrutado para novos intensificadores neuronais ligados pelo Onecut1 TF para manter a expressão genética dos genes efeitos neuronais. Neste estudo, o ChIP-exo revelou como vários TFs reconhecem dinamicamente o tipo celular e elementos regulatórios de DNA específicos do estágio celular de forma combinatória na resolução de mapeamento de quase nucleotídeos. Outros estudos também usaram o método ChIP-exo para entender a interação entre proteínas e DNA em outras linhas celulares de mamíferos. Han et al.7 usaram ChIP-exo para examinar a organização genoma de GATA1 e TAL1 TFs em células eritróides de camundongos usando ChIP-exo. Este estudo descobriu que o TAL1 é diretamente recrutado para o DNA e não indiretamente através de interações proteína-proteína com GATA1 ao longo da diferenciação eritrócrio. Estudos recentes também usaram ChIP-exo para traçar o perfil dos locais de ligação em todo o genoma de CTCF, RNA Polymerase II e histonas para estudar mecanismos epigenômicos e transcricionais nas linhas celulares humanas18,19.
Existem várias versões do protocolo ChIP-exo disponíveis3,5,20. No entanto, esses protocolos ChIP-exo são difíceis de seguir para pesquisas que não estão familiarizados com a preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração. Uma excelente versão do protocolo ChIP-exo foi publicada com instruções fáceis de seguir e um vídeo21,mas continha muitas etapas enzimáticas que requerem uma quantidade significativa de tempo para ser concluída. Aqui relatamos uma nova versão do protocolo ChIP-exo contendo etapas enzimáticas reduzidas e tempos de incubação, e explicações para cada etapa enzimática21. O reparo final e as reações de cauda dA são combinadas em um único passo usando enzima de preparação final. Os tempos de incubação para etapas de ligadura de índice e adaptador universal são reduzidos de 2h para 15 min usando um melhorador de ligadura. A reação de quinase após a etapa de ligadura do adaptador de índice descrita no protocolo ChIP-exo anterior é removida. Em vez disso, um grupo de fosfato é adicionado durante a síntese de DNA oligo a uma das extremidades de 5′ do adaptador de índice(Tabela 1), que será usado para a etapa de digestão de exonuclease lambda. Enquanto o protocolo chip-exo anterior usou recJf digestão exonuclease para eliminar contaminantes de DNA de uma única cadeia, este passo de digestão é removido aqui porque não é crítico para a qualidade da biblioteca ChIP-exo. Além disso, para purificar o DNA cruzado reverso após a elução do ChIP, um método de purificação de contas magnéticas é usado em vez do método de extração fenol:clorofórmio:isoamyl álcool (PCIA). Isso reduz o tempo de incubação da extração de DNA. É importante ressaltar que ele remove a maioria dos dimers adaptadores formados durante a ligante do adaptador de índice, o que pode afetar a eficiência do PCR mediado por ligadura.
O protocolo ChIP-exo apresentado aqui é otimizado para a detecção de interações proteicas precisas e DNA em neurônios mamíferos diferenciados das células-tronco embrionárias do camundongo (ES). Brevemente, as células neuronais colhidas e cruzadas são lísedas, para permitir que a cromatina seja exposta à sônica, e depois sônica para que fragmentos de DNA de tamanho adequado sejam obtidos(Figura 1). As contas revestidas de anticorpos são então usadas para imunoprecipitar seletivamente cromatina fragmentada e solúvel à proteína de interesse. Enquanto o DNA imunoprecipitado ainda está nas contas, reparação final, ligadura de adaptadores de sequenciamento, reação de preenchimento e passos de digestão exonuclease lambda de 5′ a 3′ são realizados. O passo de digestão exonuclease é o que dá ao ChIP-exo sua ultra-alta resolução e alta relação sinal-ruído. Lambda exonuclease apara o DNA imunoprecipitado alguns pares de base (bp) do local de crosslinking, fazendo com que o DNA contaminante seja degradado. O DNA ChIP tratado pela exonuclease é eludido das contas revestidas de anticorpos, os crosslinks de DNA proteico são invertidos e as proteínas são degradadas. O DNA é extraído e desnaturado ao DNA ChIP de um único fio, seguido de ressarem e extensão para fazer DNA de dupla derivação (dsDNA). Em seguida, é realizada a ligadura de um adaptador universal para as extremidades tratadas com exonuclease. O DNA resultante é purificado, então PCR amplificado, gel purificado e submetido ao sequenciamento de próxima geração.
O protocolo ChIP-exo é mais longo que o protocolo ChIP-seq, mas não é muito desafiador tecnicamente. Qualquer DNA ChIP imunoprecipitado com sucesso pode ser submetido a ChIP-exo, com várias etapas enzimáticas adicionais. As notáveis vantagens do ChIP-exo, como resolução de mapeamento ultra-alta, um sinal de fundo reduzido e diminuição de falsos positivos e negativos, em relação a sites de vinculação genômica, superam o custo de tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, o ChIP seguido pela digestão exonuclease é usado para obter bibliotecas de DNA para a identificação de interações proteína-DNA em células de mamíferos em resolução de mapeamento ultra-alta. Muitas variáveis contribuem para a qualidade do experimento ChIP-exo. Parâmetros experimentais críticos incluem a qualidade dos anticorpos, a otimização da sônica e o número de ciclos LM-PCR. Esses parâmetros experimentais críticos também são o que pode limitar os experimentos chip-exo e serão d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao membro do laboratório Rhee por compartilhar dados inéditos e discussões valiosas. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) que concede RGPIN-2018-06404 (H.R.).
Materials
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 – 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
Referências
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L., A, J. e. l. t. s. c. h., Rots, M. G. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Simplified ChIP-exo assays. Nature Communications. 9 (1), 2842 (2018).
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
