Aislamiento de células endoteliales endocardiales y coronarias de la pared libre ventricular del corazón de rata

Summary

Presentamos un protocolo para el aislamiento de células endoteliales endocardiales y coronarias de corazones de rata a través de la digestión secuencial del tejido en un tampón de digestión, la recolección celular de ciclos de centrífuga recurrentes y la purificación celular mediante microperlas CD31 anti-rata.

Abstract

Se ha demostrado que las células endoteliales endocardiales (ECEP) y las células endoteliales coronarias (CEC) difieren en origen, desarrollo, marcadores y funciones. En consecuencia, estas dos poblaciones celulares desempeñan un papel único en las enfermedades cardíacas. Estudios actuales con células endoteliales aisladas investigan poblaciones celulares compuestas tanto por CEC como en CEC. Este protocolo describe un método para aislar de forma independiente estas dos poblaciones de células para la caracterización específica de la celda. Después de la recolección de la pared libre ventricular izquierda y derecha, las células endoteliales de la superficie exterior y la superficie interna se liberan por separado utilizando una solución de amortiguación de digestión. La digestión secuencial de la superficie exterior y la capa interna endocardial retuvieron la separación de las dos poblaciones de células endoteliales. El aislamiento separado de las CEC y las CEC se verifica aún más mediante la identificación de marcadores específicos para cada población. Basado en la generación de perfiles de ARN de una sola célula publicados anteriormente en el corazón del ratón, la expresión génica Npr3, Hapln1y Cdh11 es única para las CE; mientras que la expresión génica Fabp4, Mglly Cd36 es única para los CEC. Los datos qPCR revelaron una expresión enriquecida de estos marcadores característicos en sus respectivas muestras, lo que indica el aislamiento exitoso de la CEE y la CEC, así como el mantenimiento del fenotipo celular, lo que permite un análisis funcional específico de las células.

Introduction

Este artículo proporciona un protocolo detallado (modificado de Gladka et al.¹) para la disección y posterior aislamiento de células endoteliales endocardiales (ECEP) y células endoteliales coronarias (CEC) de corazones de rata. La capacidad de investigar estas poblaciones celulares de forma independiente permitiría la exploración de mecanismos específicos de tipo celular subyacentes a una variedad de enfermedades cardíacas que podrían servir como posibles dianas terapéuticas. Sin embargo, aún no se ha publicado un método exitoso para la recopilación de estas poblaciones celulares de forma independiente.

Las CEC difieren de las CEO en cuanto a su origen, marcadores y funciones durante el desarrollo cardíaco y la enfermedad^{1,2,3,4,5,6,7}. Las ECE provienen de la superficie ventrales del mesodermo cardíaco³. Surgen de células Flk1⁺ progenitoras en respuesta a la señalización VEGF e HIF y forman la capa más interna de las tres regiones discretas del corazón en desarrollo: la aurícula, el ventrículo y el venoso sinusal^3,6. El rastreo genético del linaje sugiere que las células endocardiales pluripotentes del sinus venosus derivan células venosas, que migran para formar la capa subepicardial^3. Posteriormente, la capa subepicardial se diferencia en arterias y venas coronarias, incluyendo CEC, que permanecen a través de la pared libre ventricular periférica^3,4. Esta vía endocardial a endotelial está regulada por la señalización VEGFC, ELA/APJ y SOX17^3,4,6,8,9. El endocardio ventricular deriva el menor ceC del tabique interventricular por un mecanismo desconocido^3. Posteriormente, la diferenciación localizada entre LAS CEOs y las CEC se sugiere mediante marcadores específicos para estas dos poblaciones celulares, incluida la expresión Mgll, Fabp4 y Cd36 en CEC, o expresión Npr3, Cdh11 y Hapln1 en eECs^3,5,10.

Las CEE y las CEC desempeñan diferentes funciones en la función cardíaca. La transición endocardial a mesenquimal, la formación de válvulas, la maduración de la cámara, la regulación del tracto de salida y el desarrollo del canal auriculoventricular están supeditados a las CEE^6. Alternativamente, los CCCe contribuyen al tono vasomotor y a la inflamación de las arterias coronarias^11. Estas varianzas en la función dan lugar a roles individualizados en el desarrollo de la enfermedad^4,12. Por ejemplo, la evidencia sugiere que el mal funcionamiento de las EEC puede conducir a la enfermedad de la válvula congénita⁶, no compaccion myocardium⁶, efecto septal auriculoventricular⁶, fibroelastosis endocardial¹³, síndrome del corazón izquierdo hipoplásico¹³, hipoplasia ventricular¹³e hipertrofia cardíaca¹². Del mismo modo, los estudios han encontrado que los ENC anormales contribuyen a la enfermedad de las arterias coronarias¹⁴ y a la trombosis^11.

El aislamiento exitoso de las CEC y las CEC es necesario para lograr un conocimiento integral de estas dos poblaciones celulares, que podrían utilizarse tanto en la investigación como en los entornos clínicos. Determinar los factores de crecimiento y diferenciación de estas poblaciones celulares proporcionaría una referencia para la diferenciación de subtipos endoteliales de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Además, la identificación completa de las varianzas en el desarrollo, la regulación y la función de las CEC y las CEC es vital para comprender los factores genómicos y epigenómicos responsables de numerosas enfermedades cardíacas de una manera específica del tipo de célula. En este artículo se describen los pasos para la recopilación exitosa de CEC y CEC de forma independiente, y se proporcionan pruebas de separación mediante la evaluación de los niveles de expresión génica de los marcadores específicos del tipo de célula.

Protocol

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Panel Administrativo sobre Cuidado de Animales de Laboratorio (APLAC31608) en la Universidad de Stanford. 1. Preparación de tampones Prepare el tampón de digestión utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 1. Preparar la solución de stock DNase I: Disolver DNase I en agua libre de RNase para una solución de stock de 2.000 unidades/ml (1 mg/ml). Aliquot y almacenar la solución de stock a -20 oC. Preparar la solución liberadora: Disolver libera con agua libre de RNase para una solución en stock de 5 mg/ml. Gire en una caja de rodillos a 4 oC durante 30 minutos aliquot y almacene la solución de stock a -20 oC. Preparar el tampón de clasificación diluyendo 0,5 M de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) y 10% de albúmina sérica bovina (BSA) con 1 solución salina tamponada de fosfato (PBS) para una concentración final de 2 mM de EDTA y 0,5% de BSA. 2. Colección de corazones NOTA: En este protocolo se utilizaron seis ratas Sprague Dawley que pesaban entre 50 y 100 g. No se observó ninguna diferencia de género. Eutanasia la rata con CO2 y colóquela en posición supina sobre una plataforma de diseción. Anclar las extremidades hacia abajo y esterilizar tanto el abdomen como el pecho con 70% de etanol. Abra el abdomen con tijeras e inserte una aguja de 21 G en la porción de la vena cava posterior situada detrás de los intestinos. Tire del émbolo de la jeringa hacia atrás, retirando la sangre de la vena hasta que el hígado parezca más claro de color y no se pueda extraer más sangre, lo que indica suficiente extracción de sangre. Con tijeras, abra el pecho cuidadosamente para evitar dañar el pulmón y el corazón. Levante el arco/aurícula de la aorta con los fórceps y corte la aorta, la arteria pulmonar, las venas pulmonares y la vena cava para liberar y extraer el corazón. Lavar el corazón con 50 ml de tampón de solución salina equilibrada (HBSS) de 50 ml de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) 3 veces para eliminar el exceso de sangre. Bajo un microscopio de microdisección, retire la pared libre ventricular derecha en un tubo de 5 ml que contenga el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco(Figura 1A,B). Poner el corazón en su cara más plana, posterior para identificar el lado izquierdo y derecho. Localice la arteria pulmonar, la más anterior de las venas y arterias que se ramifican desde la parte superior del corazón y corte a través de la arteria pulmonar hasta la cámara ventricular derecha. En la cara anterior del corazón, corte a lo largo del tabique hasta llegar al ápice. Continúe cortando desde el ápice hacia arriba el lado posterior del corazón a lo largo del tabique hasta la arteria pulmonar y el punto de unión de la cámara ventricular derecha(Figura 1A). A partir de la arteria pulmonar y el punto de unión ventricular derecha, corte el lado anterior y posterior del corazón perpendicularmente a la disección anterior y lejos del tabique, hasta que la pared libre ventricular derecha se libere del resto del corazón(Figura 1B). Bajo el microscopio de microdisección, retire la pared libre del ventrículo izquierdo en un tubo de 5 ml que contenga DMEM(Figura 1C,D). Localice la aorta, ramificándose desde la parte superior del corazón detrás de la arteria pulmonar, y repita el método descrito en el paso 2.5 para cortar la pared libre del ventíndor izquierdo. 3. Digestión CEE Coloque los tejidos de pared libre del ventular derecho e izquierdo en un plato de cultivo de 60 cm con la superficie interior acostada plana, mirando hacia abajo(Figura 2).NOTA: La superficie interior es la cara interior del ventrículo de forma ligeramente cóncava, como se muestra en la Figura 2A,C. Añadir 0,5–1 ml de tampón de digestión al plato, colocando la punta de la pipeta directamente debajo del tejido. Continúe hasta que sólo se sumerja la superficie interior. Incubar el plato en una incubadora de CO2al 5%, 37oC durante 5 min. Agregue el medio EC al plato de cultivo para detener la digestión.NOTA: Mantenga la cantidad de tampón de digestión en medio EC como una proporción de 1:5. Utilice una pipeta de 1 ml para vaciar la superficie interna de los ventrículos con medio EC y transferir la escorrenta a un tubo de recogida de 50 ml a través de un colador de 40 mm(Figura 2E). Mantenga las colecciones en hielo para su purificación aguas abajo. 4. Digestión CEC Corte a lo largo de la superficie exterior del ventrículo izquierdo sin contaminación de la capa interna(Figura 2B,D)y coloque cada uno en un tubo separado de 5 ml que contenga 1 ml del tampón de digestión.NOTA: El ventrículo izquierdo se puede identificar como el ventrículo más grueso, y la superficie exterior se puede determinar como la cara exterior del ventrículo ligeramente cóncavo. Usando tijeras de disección, picar la pared ventricular en pequeñas piezas de 1 mm3. Incubar el tubo en un baño de agua de 37 oC durante unos 15-20 minutos de vórtice cada 2-3 min. Pipetear 4 ml de medio EC en el tubo de 5 ml para terminar la digestión. Transfiera la solución con una pipeta serológica de 5 ml a un tubo de 50 ml a través de un colador de 40 mm(Figura 2E). Mantenga las colecciones en hielo para su purificación aguas abajo. 5. Colección de células Centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) y luego aspirar el sobrenadante. Si el pellet aparece rojo, resuspenda el pellet en 1–2 ml de 1x tampón de lising de glóbulos rojos (RBC)(Figura 2F).NOTA: Si no hay RCO, continúe con el paso 6. Incubar los tubos en un baño de agua de 37oC durante 5 min. Pipetear 10 ml de PBS en los tubos de 50 ml para detener la lisis. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 minutos en RT, y luego aspirar el sobrenadante. 6. Clasificación CE Añadir 90 ml de tampón de clasificación y 10 l de anticuerpo anti-CD31 PE en los tubos de 50 ml. Vortex los tubos y luego incubarlos durante 10 minutos en un refrigerador de 4 oC. Añadir 10 ml de tampón de clasificación en los tubos, mezclar a fondo, y luego centrifugar a 300 x g durante 10 minutos en RT. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 80 l de tampón de clasificación y 20 l de microperlas. Vortic los tubos e incubar a 4oC durante 15 min. Lave las células agregando 10 ml de tampón de clasificación en los tubos, mezcle bien y luego centrifugarlas a 300 x g durante 10 minutos a RT. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 l de tampón de clasificación. Coloque una columna que contenga esferas superparamagnéticas en un separador magnético y enjuague la columna con 3 ml de tampón de clasificación. Después de que la columna sea “parada de flujo”, pipeta 500 l de la suspensión celular en las columnas y luego lave las columnas con búfer de clasificación. Repita el lavado 3x, cada uno con 3 ml de búfer de clasificación(Figura 2G). Retire las columnas del separador y colóquelas encima de un nuevo tubo de recogida de 15 ml. Con una pipeta, añada 5 ml de medio EC a las columnas e propulse la solución mediante un émbolo de columna. Centrifugar los tubos de recogida a 300 x g durante 10 minutos a RT y luego aspirar el sobrenadante. Extraiga el ARN del pellet celular de las muestras CEE y CEC utilizando un kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se puede obtener un mínimo de 500 ng de ARN.NOTA: Después de la extracción del ARN, la muestra se puede almacenar a -80 oC. Trasvierta 500 ng de ARN para obtener ADNc usando una imprimación aleatoria y un kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. Realizar un ITP cuantitativo para la validación de poblaciones endocardiales y endoteliales(Figura 2H). Las secuencias de imprimación se enumeran en la Tabla 2. Añadir 5 l de ADNC CEE o CEC (1 ng/L) en los pocillos de una placa de 384 qPCR. Agregue el ADNC CEE o CEC en suficientes pozos para que haya tres pozos por número de imprimaciones. Mezclar 6 l de tampón verde QPCR SYBR de 2x con 0,5 ml de cada imprimación de 10 m, incluidas las imprimaciones delanteras e inversas, y añadirlas en un solo pozo correspondiente a cada gen candidato. Sellar la placa con película de plástico y centrífuga durante 1 min a 300 x g a RT. Coloque la placa en una máquina qPCR y, a continuación, inicie el programa a 95 oC durante 3 min, seguido de 95 oC durante 15 s, y luego 55 oC durante 60 s. Repita los dos pasos siguientes para 45 ciclos.

Representative Results

El proceso de aislamiento CEE y CEC se describe en la Figura 2. El aislamiento exitoso de las CEE y las CEC se determinó evaluando la presencia de marcadores de células pandoteliales, así como los distintos de las dos poblaciones de subtipos. Como se predijo, qPCR reveló que en relación con β-actin, los CEO expresaron niveles más altos de marcadores endocárdcos Npr3, Hapln1 y Cdh11 en comparación con los CEC(Figura 3A). Asimismo, los CCA expresaron niveles más altos de marcadores coronarios Fabp4, Mglly Cd36 en comparación con las CEC(Figura 3B). Además, tanto las CEC como las CEC expresaron el gen marcador pan-EC Cdh5, con niveles ligeramente más altos en CEC(Figura 3C). Figura 1: Diagrama de disección cardíaca. (A) Primer corte hecho para separar la pared libre del ventrículo derecho del tabique. (B) Segundo corte hecho para liberar completamente el ventrículo derecho. (C) Primer corte realizado para separar la pared libre del ventrículo izquierdo del tabique. (D) Segundo corte hecho para liberar completamente el ventrículo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Diagrama de la configuración de digestión de las CEC y CEC y la siguiente disposición para la clasificación celular. (A) La pared ventricular libre más interna y (B) la pared libre ventricular ultraperiférica se sumergieron (C) en el tampón de digestión o (D) digeridos en el tampón de digestión respectivamente. (E) Recopilación y filtración de soluciones celulares seguidas de (F) lisis de glóbulos rojos (RBC) y (G) clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) utilizando el anticuerpo CD31. (h) Los CO purificados se procesaron para la verificación de la expresión génica utilizando qPCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: datos qPCR que verifican el aislamiento de CEC y ECE. (A) Los niveles de expresión génica de los marcadores CEE Npr3, Cdh11y Hapln1 en las CEC y los CCA se cuantificaron mediante PCR en tiempo real. (B) Los niveles de expresión génica de los marcadores CEC Mgll, Fabp4y Cd36 en las CEE y los CEC se cuantificaron mediante PCR en tiempo real. (C) El marcador pan-EC Cdh5 se cuantificó en las CEC y las CEC mediante PCR en tiempo real. (n 3 en cada grupo). Las barras representan la media de la sede *p < 0,05, **p < 0,01 frente a la CEE, prueba t no emparejada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1. Búfer de digestión (1,5 ml)   Stock Con. Con final. Volumen Liberase TM 5 mg/ml 0,5 mg/ml 150 ul Dnase I 1 mg/ml 20 ug/ml 30 ul HEPES 1 M 10 mM 15 ul DMEM – – 1305 ul Tabla 1: Receta para el tampón de digestión. Cuadro 2. Secuencias de primerplano Gene Name Adelante Marcha atrás Npr3 TCCTTGCAAATCATGTGGCCTA GGAATCTTCCCGCAGCTCTC Cdh11 GTGAATGGGACTGGGACTGGGG GTAATTTCTGGGGCCCTTGC Hapln1 CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG GGGCCATTTTCACTTGGATG Mgll CCCGGGGCCCAAAGAC GAAGATGAGGGCCTTGGGTG Fabp4 AGAAGTGGGAGTTGGCTTCG ACTCTCTGACCGGATGACGA Cd36 GCAAAACGACTGCAGGTCAA CCCGGTCACTTGGTTTCTGA Cdh5 CCATTGAGACACCCGAC TGTGGAACGTGTACTGCTGG B-actin TCTGTGTGGATTGGTGGCTC CGGACTCATCGTACTCCTGC Tabla 2: Secuencias de imprimación

Discussion

Las CEC y las CEE difieren en origen, marcadores y funciones, por lo que podrían desempeñar un papel único en el desarrollo y las enfermedades. Los protocolos existentes para el aislamiento de células endoteliales se limitan a los tejidos macrovasculares, descuidando la recolección de CEO, restringiendo así el estudio de las funciones específicas de cec y CEE. Es esencial aislar y estudiar estas dos poblaciones de forma independiente, ya que este conocimiento proporcionaría una referencia para la diferenciación de los CIE en CEC y CEC para futuros estudios y facilitaría el examen de estas poblaciones celulares en busca de posibles dianas terapéuticas para diversas enfermedades cardíacas. Este novedoso protocolo describe un método para el aislamiento de los CEE de la superficie interna y los CEC de la superficie exterior de la pared libre ventricular de ratas adultas.

Es fundamental controlar la sincronización de cada paso con mucha precisión en este protocolo. Debido a que el número de EEC es muy limitado en el tejido del corazón de rata, minimizamos el tiempo de digestión de la capa interna del corazón para prevenir el daño celular y, lo que es más importante, la contaminación por CEC. La adición inmediata de la solución media CE para poner fin a la reacción enzimática también es muy importante para mantener una alta viabilidad celular. Un pellet rojo después de la recolección de células sugiere la presencia de un gran número de glóbulos rojos. Dependiendo de la cantidad de contaminación por RBC, se puede agregar 1-2 ml de tampón de lisis RBC para degradar los glóbulos rojos. Usando el protocolo actual, pudimos aislar 10⁵ EECs de seis corazones de ratas. Estas células podrían ser sembradas en un plato de cultivo celular para una mayor expansión y caracterización.

Al preparar el tejido para la recolección libre de la pared, el corazón fue lavado con HBSS para eliminar la mayoría de los glóbulos rojos restantes. La composición del tampón de digestión asegura una liberación suficiente de las células endoteliales, donde la enzima de digestión liberasa el tejido de las células expuestas, DNase I elimina el ADN de las células muertas para promover el desprendimiento celular que puede ser inhibido por la calidad adhesiva del ADN, HEPES buffer equilibra el pH, y DMEM es un medio basal modificado con una mayor concentración de aminoácidos y vitaminas para un mejor mantenimiento celular y contiene el calcio necesario para activar la liberación.

Según la secuenciación del ARN de una sola célula (scRNA-seq) obtenida de¹⁵ humanos y del corazón del ratón^10,se notificaron varios marcadores atribuidos a poblaciones específicas de la CE. Seleccionamos algunos de los genes más enriquecidos para examinar la pureza de las EEC aisladas (es decir, Npr3, Cdh11y Hapln1)y las EEC (es decir, Mgll, Fabp4y Cd36). En relación con los marcadores β-Actin, Npr3, Cdh11y Hapln1, se ha demostrado un aumento de la expresión en los CEC en comparación con los CEC. Del mismo modo, la expresión de los marcadores Mgll, Fabp4y Cd36 fue mayor en los CEC en comparación con los CEC. Los marcadores expresados de forma única para cada muestra están de acuerdo con los marcadores característicos de las CEC y las CEC, respectivamente, lo que indica un aislamiento satisfactorio.

Sin embargo, el protocolo actual no puede descartar la contaminación cruzada entre las dos poblaciones de las CE durante el aislamiento, incluso con digestiones secuenciales cuidadosamente controladas. Por lo tanto, algunos marcadores de superficie celular se pueden aplicar para una mayor purificación. Por ejemplo, NPR3 generalmente etiqueta el endocardio¹⁰, mientras que APJ puede rastrear la mayoría de los CCEP¹⁶. Debido a que estos dos marcadores se expresan en la superficie celular, podrían utilizarse para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y los anticuerpos utilizados para purificar aún más las poblaciones EC distintas. Además, el¹⁵ humano y el ratón¹⁰ corazón scRNA-seq pueden confirmar el enriquecimiento de Npr3 en eEC, y Cd36 se puede utilizar potencialmente para la purificación CEC.

En conclusión, el protocolo presentado describe el aislamiento independiente de las CEC y las CEC del corazón de la rata. La identificación integral de las propiedades celulares, habilitada por el aislamiento celular, se puede utilizar para aplicaciones descendentes significativas.

Materials

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco	15630080	1M
15ml Tubes	Eppendorf	0030122151
50ml Tubes	Nunc	339652
5ml Tubes	Eppendorf	30119401
ACK Lysing Buffer	Gibco	A1049201
Anti-CD31 PE	Miltenyi Biotec	130-115-505
Anti-PE microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Bovine serum albumin (BSA)	Miltenyi Biotec	130-091-376	10%
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-rad	1855485	For qPCR
DNAse I	Worthington	LK 003172	1 mg/mL in water
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10313021
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)	Lonza	CC-3162	EC Medium
Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15575020	0.5 M
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1	Gibco	14025092
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-rad	HSP3805	For qPCR
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368813
Liberase TM	Sigma Aldrich	5401119001	5 mg/mL
MACS LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401	For EC isolation
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-302	For EC isolation
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-rad	MSB1001	For qPCR
Narrow Pattern Forceps	F.S.T	11002-12	For heart harvest
Nylon Sterile Strainer	Falcon	352340	40 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS) X1	Gibco	1001023
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	For qPCR
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1050	For RNA extraction
S&T Forceps – SuperGrip Tips	F.S.T	00632-11	For heart harvest
Strabismus Scissors – Tungsten Carbide	F.S.T	14574-11	For heart harvest
Vannas Spring Scissors – Microserrated	F.S.T	15007-08	For heart harvest