Isolering av endokardiella och koronar endotelceller från Ventrikulärt Fria väggen i Råtthjärtat

Summary

Vi presenterar ett protokoll för isolering av endokardiella och födans endotel celler från råtta hjärtan genom sekventiell vävnad matsmältningen i en matsmältningen buffert, cell insamling från återkommande centrifug cykler och cell rening med anti-råtta CD31 microbeads.

Abstract

Det har visat sig att endokardiella endotelceller (EECs) och koronar endotelceller (CECs) skiljer sig åt i ursprung, utveckling, markörer och funktioner. Följaktligen spelar dessa två cellpopulationer unika roller i hjärtsjukdomar. Aktuella studier med isolerade endotelceller undersöker cellpopulationer som består av både EECs och CECs. Det här protokollet beskriver en metod för att självständigt isolera dessa två cellpopulationer för cellspecifik karakterisering. Efter insamling av den vänstra och högra ventrikulära fria väggen frigörs endotelceller från den yttre ytan och den inre ytan separat med hjälp av en rötningsbuffertlösning. Den sekventiella matsmältningen av den yttre ytan och den inre endokardiell skiktet behöll separation av de två endotel cell populationer. Den separata isoleringen av EIC och Central- och östeuropeiska länder kontrolleras ytterligare genom identifiering av markörer som är specifika för varje population. Baserat på tidigare publicerad encellig RNA-profilering i mushjärtat är genuttrycket Npr3, Hapln1och Cdh11 unikt för EBC; medan Fabp4, Mglloch Cd36 genuttryck är unik för CECs. qPCR-data visade berikat uttryck för dessa karakteristiska markörer i sina respektive prover, som anger framgångsrik EEG- och CEC-isolering, samt underhåll av cellfenotyp, vilket möjliggör ytterligare cellspecifik funktionell analys.

Introduction

Denna artikel ger ett detaljerat protokoll (ändrad från Gladka et al.¹) för dissekering och efterföljande isolering av endokrial endotelceller (EECs) och koronar endotelceller (CECs) från råtthjärtan. Förmågan att självständigt undersöka dessa cellpopulationer skulle möjliggöra utforskning av celltypspecifika mekanismer bakom en mängd olika hjärtsjukdomar som skulle kunna fungera som potentiella terapeutiska mål. En framgångsrik metod för insamling av dessa cellpopulationer självständigt har dock ännu inte offentliggjorts.

Central- och östeuropeiska länder skiljer sig från EECs när det gäller ursprung, markörer och funktioner under hjärtutveckling och sjukdom^{1,,2,,3,,4,,5,,6,7}. EECs härrör från ventrala ytan av hjärt mesoderm³. De uppstår från Flk1⁺ stamceller som svar på VEGF och HIF signalering och utgör det innersta lagret av de tre diskreta regionerna i det växande hjärtat: atriumet, ventrikeln och sinus venosus^3,6. Genetisk härstamning spårning tyder på att pluripotenta endokardiella celler i sinus venosus härleda venösa celler, som migrerar för att bilda subepicardial^{skiktet 3}. Därefter skiljer subepicardial skiktet i kranskärl och vener, inklusive CECs, som förblir över perifera Ventrikulärt fri vägg^3,4. Denna endokardiella till endotel väg regleras av VEGFC, ELA / APJ, och SOX17 signalering^3,,4,,6,8,9. Ventrikulärt endokardiet härleder de färre central- och östeuropeiska länderna i interventricular septum med en okänd mekanism³. Därefter föreslås lokaliserad differentiering mellan EECs och CECs av markörer som är specifika för dessa två cellpopulationer, inklusive Mgll, Fabp4 och Cd36 uttryck i CECs, eller Npr3, Cdh11 och Hapln1 uttryck i EECs^3,5,10.

EECs och CENTRAL- och östeuropeiska länder spelar olika roller i hjärtfunktionen. Endokardiell till mesenkymal övergång, ventilbildning, kammarmognad, utflödeskanalreglering och atrioventricular kanalutveckling är beroende av EECs⁶. Alternativt bidrar CECs till vasomotorisk ton och inflammation i kranskärl¹¹. Dessa variationer i funktion resulterar i individualiserade roller i sjukdomsutveckling^4,12. Till exempel, bevis tyder på att felaktige EECs kan leda till medfödd ventil sjukdom⁶, icke-compaction hjärtmuskeln⁶, atrioventricular septal effekt⁶, endokardiell fibroelastosis¹³, hypoplastiskt vänster hjärtsyndrom¹³, Ventrikulärt hypoplasi¹³, och hjärt hypertrofi¹². På samma sätt har studier visat att onormala cecs bidrar till kranskärlssjukdom¹⁴ och trombos¹¹.

Framgångsrik isolering av EED och CENTRAL- och östeuropeiska länder är nödvändig för att uppnå omfattande kunskap om dessa två cellpopulationer, som skulle kunna användas i både forsknings- och kliniska miljöer. Fastställande av tillväxt- och differentieringsfaktorerna för dessa cellpopulationer skulle ge en referens för differentiering av endotelsubtyper från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). Vidare är fullständig identifiering av varianserna i EECs och Central- och östeuropeiska länders och central- och östeuropeiska länders utveckling, reglering och funktion avgörande för att förstå de genomiska och epigenomiska faktorer som är ansvariga för många hjärtsjukdomar på ett celltypspecifikt sätt. I den här artikeln beskrivs steg för en framgångsrik samling av EECs och CENTRAL- och östeuropeiska länder oberoende av detta och ger belägg för separation genom att bedöma genuttrycksnivåerna för celltypspecifika markörer.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av den administrativa panelen för laboratoriedjurvård (APLAC31608) vid Stanford University. 1. Beredning av buffertar Förbered rötningsbufferten med hjälp av reagenserna i tabell 1. Förbered DNase I-stamlösningen: Lös DNase I i RNase-fritt vatten för en stamlösning på 2 000 enheter/ml (1 mg/ml). Aliquot och förvara lagerlösningen vid -20 °C. Förbered liberaslösningen: Lös liberas med RNase-fritt vatten för en stamlösning på 5 mg/ml. Rotera den på en rullbank vid 4 °C i 30 min. Aliquot och förvara stamlösningen vid -20 °C. Beredta och 10 % bovin serumalbuminlösning (BSA) med 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för en slutlig koncentration på 2 mM EDTA och 0,5 % BSA.Prepare the sorting buffert by späda ut 0,5 M etylengaminettraättsyra (EDTA) och 10 % bovin serumalbumin (BSA) med 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för en slutlig koncentration på 2 mM EDTA och 0,5 % BSA. 2. Hjärtsamling OBS: Sex Sprague Dawley råttor som väger 50-100 g användes i detta protokoll. Ingen könsskillnad observerades. Avliva råttan med CO2 och placera den i en ryggläge på en dissekeringsplattform. Pin extremiteterna ner och sterilisera både buken och bröstet med 70% etanol. Öppna buken med sax och sätt in en 21 G nål i den del av den bakre vena cava som ligger bakom tarmarna. Dra tillbaka sprutkolven och dra tillbaka blodet från venen tills levern verkar ljusare till färgen och inget mer blod kan dras tillbaka, vilket tyder på tillräckligt med blodborttagning. Använd sax, öppna bröstet försiktigt för att undvika att skada lungan och hjärtat. Lyft aortabågen/atriumet med pincetten och skär aorta, lungartär, lungvener och vena cava för att befria och ta bort hjärtat. Tvätta hjärtat med 50 ml kall 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) buffert 3x för att avlägsna överdrivet blod. Under ett mikrodissectionmikroskop, ta bort den högra ventrikulära fria väggen i ett 5 ml-rör som innehåller Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) (figur 1A,B). Lägg hjärtat på dess plattare, bakre ansikte för att identifiera vänster och höger sida. Lokalisera pulmonell artär, den mest främre av venerna och artärerna förgrening från toppen av hjärtat och skär genom lungartären ner till rätt Ventrikulärt kammare. På hjärtats främre ansikte, skär längs septumet tills du når spetsen. Fortsätt skära från spetsen upp den bakre sidan av hjärtat längs septum tills lungartären och höger ventrikulära kammaren knutpunkten (Figur 1A). Från lungartären och höger ventrikulära knutpunkten, skär både den främre och bakre sidan av hjärtat vinkelrätt till föregående dissekering och bort från septum, tills den högra ventrikulära fria väggen frigörs från resten av hjärtat (Figur 1B). Under mikrodissectionmikroskopet, ta bort den vänstra ventrikulära fria väggen i ett 5 ml-rör som innehåller DMEM (figur 1C,D). Lokalisera aorta, förgrening från toppen av hjärtat bakom lungartären, och upprepa den metod som beskrivs i steg 2.5 för att skära av den vänstra ventrikulära fria väggen. 3. EEG-rötning Placera både höger och vänster ventrikulära fria väggvävnader i en 60 cm kulturskål med den inre ytan liggande platt, vänd nedåt (figur 2).OBS: Den inre ytan är den inre ytan av den något konkava formade ventrikeln som visas i figur 2A,C. Tillsätt 0,5–1 ml rötningsbuffert till skålen och placera pipettens spets direkt under vävnaden. Fortsätt tills endast den inre ytan är nedsänkt. Inkubera skålen i en 5% CO2, 37 °C inkubator i 5 min. Tillsätt EG-medium till kulturskålen för att stoppa matsmältningen.OBS: Håll mängden rötningsbuffert till EG-medium som ett 1:5-förhållande. Använd en 1 ml-pipett för att spola ventriklarnas inre yta med EC-medium och överför avrinningen till ett 50 ml uppsamlingsrör genom en 40 mm sil (figur 2E). Förvara samlingarna på is för nedströmsrening. 4. CEC-rötning Skär längs den vänstra ventrikelns utsida utan kontaminering från det inre lagret (figur 2B,D) och placera var och en i ett separat 5 ml-rör som innehåller 1 ml av rötningsbufferten.OBS: Den vänstra ventrikeln kan identifieras som den tjockare ventrikeln, och den yttre ytan kan bestämmas som utsidan av den något konkava ventrikeln. Med hjälp av dissekering sax, färs ventrikulära väggen i små, 1 mm3 stycken. Inkubera röret i ett 37 °C vattenbad i ca 15–20 min. Vortex var 2–3 minut. Pipett 4 ml EC medium i 5 ml-röret för att avsluta matsmältningen. Överför lösningen med en 5 ml serologisk pipett till ett 50 ml-rör genom en 40 mm sil (figur 2E). Förvara samlingarna på is för nedströmsrening. 5. Cellsamling Centrifugera rören vid 300 x g i 10 min vid rumstemperatur (RT) och aspirera sedan supernatanten. Om pelleten syns röd, sätt tillbaka pelleten i 1–2 ml 1x röda blodkroppar (RBC) lysingbuffert (figur 2F).OM det inte finns några RBC:er går du vidare till steg 6. Inkubera rören i ett 37 °C vattenbad i 5 min. Pipettera 10 ml PBS i 50 ml-rören för att stoppa lysen. Centrifugera rören i 300 x g i 10 min vid RT, och aspirera sedan supernatanten. 6. EG-sortering Tillsätt 90 μL sorteringsbuffert och 10 μl anti-CD31 PE-antikropp i 50 ml-rören. Vortex rören och sedan ruva dem i 10 min i en 4 ° C kylskåp. Tillsätt 10 ml sorteringsbuffert i rören, blanda noggrant och centrifugera sedan vid 300 x g i 10 min vid RT. Aspirera supernatanten och resuspend pelleten i 80 μL sorteringsbuffert och 20 μL anti-PE-mikropärlor. Vortex rören och inkubera vid 4 °C i 15 min. Tvätta cellerna genom att lägga till 10 ml sorteringsbuffert i rören, blanda noggrant och centrifugera dem sedan vid 300 x g i 10 min vid RT. Aspirera supernatanten och resuspend pelleten i 500 μL sorteringsbuffert. Placera en kolumn som innehåller superparagnegenetiska sfärer i en magnetisk avgränsare och skölj kolonnen med 3 ml sorteringsbuffert. Efter att kolonnen är “flödesstopp”, pipett 500 μL av cellfjädringen i kolumnerna och tvätta sedan kolumnerna med sorteringsbuffert. Upprepa tvätten 3x, var och en med 3 ml sorteringsbuffert (bild 2G). Ta bort kolumnerna från separatorn och placera dem ovanpå ett nytt 15 ml-uppsamlingsrör. Med en pipett, tillsätt 5 ml EC-medium till kolumnerna och driva lösningen genom att använda en kolonnkolv. Centrifugera uppsamlingsrören i 300 x g i 10 min vid RT och aspirera sedan supernatanten. Extrahera RNA från cellpelleterna i EEG- och CEC-proverna med hjälp av ett kit, i dess anvisningar. Minst 500 ng ng RNA kan erhållas.OBS: Efter RNA-extraktion kan provet förvaras vid -80 °C. Omvänd transkribera 500 ng ng RNA för att få cDNA med hjälp av en slumpmässig primer och ett kit, enligt tillverkarens instruktioner. Utför kvantitativ PCR för validering av endokardiella och endotelpopulationer (figur 2H). Primersekvenser listas i tabell 2. Tillsätt 5 μl EEG- eller CEC cDNA (1 ng/μL) i brunnarna på en 384 qPCR-platta. Lägg till EEG eller CEC cDNA i tillräckligt bras så att det finns tre brunnar per antal grundfärger. Blanda 6 μL 2x qPCR SYBR grön buffert med 0,5 μL av varje 10 μM primer, inklusive både framåt och omvänd primers, och tillsätt dem i en enda brunn som motsvarar varje kandidatgen. Täta plattan med plastfilm och centrifug i 1 min vid 300 x g vid RT. Placera plattan i en qPCR-maskin och starta sedan programmet vid 95 °C i 3 min, följt av 95 °C för 15 s, och sedan 55 °C för 60 s. Upprepa de följande två stegen i 45 cykler.

Representative Results

Processen för EEG- och CEC-isolering beskrivs i figur 2. Den framgångsrika isoleringen av EECs och CECs fastställdes genom att bedöma förekomsten av pan-enottel cell markörer, liksom de som skiljer sig från de två subtyp populationer. Som förutspått visade qPCR att eECs i förhållande tillβ-aktinuttryckte högre nivåer av endokardiella markörer Npr3, Hapln1 och Cdh11 jämfört med CECs (figur 3A). β På samma sätt uttryckte central- och östeuropeiska länder högre nivåer av koronarmarkörer Fabp4, Mglloch Cd36 jämfört med EECs (figur 3B). Dessutom uttryckte både EECs och CENTRAL- och östeuropeiska länder den pan-EG-markörgenen Cdh5, med något högre nivåer i CEC (figur 3C). Figur 1: Diagram över hjärtats dissekering. (A) Första snittet görs för att separera den högra ventrikeln fri vägg från septum. (B) Andra snittet görs för att befria den högra ventrikeln helt. (C) Första snittet görs för att separera den vänstra ventrikeln fri vägg från septum. (D) Andra snittet görs för att befria den vänstra ventrikeln helt. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: Diagram över rötningsuppsättningen av central- och östeuropeiska länder och följande arrangemang för cellsortering. (A)Innersta fria ventrikulära väggen och(B)yttersta ventrikulära fri vägg var(C)nedsänkt i matsmältningsbuffert eller (D) smält i matsmältningsbuffert respektive. E)Insamling och filtrering av celllösningar följt av(F)röda blodkroppar (RBC) lys och (G) magnetiskaktiverad cellsortering (MACS) med hjälp av CD31-antikroppen. h)Renade ECs bearbetades för genuttryckskontroll med qPCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: qPCR-data som verifierar isolering av central- och östeuropeiska länder. a)Genuttrycksnivåerna för EEG-markörer npr3, cdh11och Hapln1 i EECs och Central- och östeuropeiska länder kvantifierades genom pcr i realtid. (B)Genuttryck nivåer av CEC markörer Mgll, Fabp4och Cd36 i EECs och CENTRAL- och östeuropeiska utvärderades av realtid PCR. C)Pan-EC-markören Cdh5 kvantifierades i EECs och Central- och östeuropeiska länder med PCR i realtid. (n = 3 i varje grupp). Staplar representerar medelvärdet ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 jämfört med EEG, oparat t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Tabell 1. Buffert för matsmältning (1,5 ml)   Lager Con. Sista Con. Volym Liberase TM 5 mg/ml 0,5 mg/ml 150 ul Dnase I 1 mg/ml 20 ug/ml 30 ul HEPES (AVSPES) 1 M 10 mM 15 ul DMEM (ANDRA) – – 1305 ul Tabell 1: Recept på rötningsbufferten. Tabell 2. Primer Sekvenser Gennamn Framåt Omvänd Npr3 (en) TCCTTGCAAATCATGTGGCCTA GGAATCTTCCCGCAGCTCTC Cdh11 (på andra sätt) GTGAATGGGACTGGGACTGG GTAATTTCTGGGGCCCTTGC Hapln1 (på) CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG GGGCCATTTTCAGCTTGGATG Mgll (på andra sätt) CCCGGGGCCCAAAGAC GAAGATGAGGGCCTTGGGTG Fabp4 (på andra sätt) AGAAGTGGGAGTTGGCTTCG ACTCTCTGACCGGATGAGA Cd36 (på skiva) GCAAAACGACTGCAGGTCAA CCCGGTCACTTGGTTTCTGA Cdh5 (2000)) CCATTGAGACAGACCCCGAC TGTGGAACGTGTACTGCTGG B-aktin TCTGTGTGGATTGGTGGCTC CGGACTCATCGTACTCCTGC Tabell 2: Primer Sekvenser

Discussion

Central- och östeuropeiska länder och eECs skiljer sig åt i ursprung, markörer och funktioner, och kan därför spela en unik roll i utveckling och sjukdom. Befintliga protokoll för endotelcellsisolering är begränsade till makrovaskulära vävnader, försummar insamlingen av EECs, vilket begränsar studien av CEC- och EEG-specifika funktioner. Det är viktigt att isolera och studera dessa två populationer självständigt, eftersom denna kunskap skulle ge en referens för differentiering av iPSCs i central- och östeuropeiska länder för framtida studier och underlätta undersökningen av dessa cellpopulationer för potentiella terapeutiska mål för olika hjärtsjukdomar. Detta nya protokoll beskriver en metod för isolering av EECs från den inre ytan och CECs från den yttre ytan av ventrikulära fria väggen av vuxna råttor.

Det är viktigt att kontrollera tidpunkten för varje steg mycket exakt i detta protokoll. Eftersom antalet EECs är mycket begränsad i råtta hjärtvävnad, minimerade vi matsmältningstiden för det inre lagret av hjärtat för att förhindra cellulära skador och ännu viktigare, CEC kontaminering. Omedelbar tillsats av EG-mediumlösningen för att avsluta den enzymatiska reaktionen är också mycket viktigt för att upprätthålla hög cellens livskraft. En röd pellet efter cellsamling föreslår förekomsten av ett stort antal RBCs. Beroende på mängden RBC kontaminering, 1-2 ml RBC lysis buffert kan läggas till för att försämra RBCs. Inkubation måste noggrant tidsinställs för att undvika betydande skador på cellerna, och PBS läggs omedelbart till för att avsluta reaktionen. Med hjälp av det nuvarande protokollet kunde vi isolera 10⁵ EECs från sex råtthjärtan. Dessa celler kan sås på en cell kultur skålen för ytterligare expansion och karakterisering.

Vid beredning av vävnaden för fri väggsamling, hjärtat tvättades med HBSS för att ta bort majoriteten av de återstående RBCs. HBSS är det rekommenderade mediet på grund av dess tydliga utseende, vilket möjliggör visualisering av blodkroppar, i motsats till DMED som innehåller fenol röd. Rötningsbuffertens sammansättning säkerställer tillräcklig frigörelse av endotelceller, Där liberasnedsmältningsenzym remsor vävnaden i de exponerade cellerna, DNase I eliminerar DNA från de döda cellerna för att främja cellavlossning som kan hämmas av DNA: s självhäftande kvalitet, HEPES buffert balanserar pH, och DMEM är ett modifierat basalt medium med en högre koncentration av aminosyror och vitaminer för bättre cellunderhåll och innehåller kalcium som behövs för att aktivera liberas.

Enligt den enda cell RNA sekvensering (scRNA-seq) som erhållits från både mänskliga¹⁵ och mus hjärta^10,flera markörer tillskrivs specifika EG populationer rapporterades. Vi valde ut några av de mest berikade generna för att undersöka renhetsgraden hos isolerade EECs (dvs Npr3, Cdh11och Hapln1)och EECs (dvs Mgll, Fabp4och Cd36). I förhållande tillβ-Actin, Npr3, Cdh11och Hapln1 markörer visat ökat uttryck i EECs jämfört med CECs. β På samma sätt var uttrycket för Mgll, Fabp4och Cd36 markörer större i central- och östeuropeiska länder jämfört med EECs. De unikt uttryckta markörer för varje prov överensstämmer med markörer som är karakteristiska för EECs respektive Central- och östeuropeiska länder, vilket indikerar lyckad isolering.

Det nuvarande protokollet kan dock inte utesluta korskontaminering mellan de två EG-populationerna under isoleringen, inte ens med noggrant kontrollerade sekventiella matsmältningssammandragningar. Därför kan vissa cellytmarkörer användas för ytterligare rening. Npr3 märker till exempel i allmänhet endokardiet^10,medan APJ kan spåra en majoritet av de central- och östeuropeiska länderna¹⁶. Eftersom dessa två markörer uttrycks på cellytan kan de användas för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och antikroppar som används för att ytterligare rena olika EG-populationer. Dessutom kan mänskliga¹⁵ och mus¹⁰ hjärta scRNA-seq bekräfta anrikning av Npr3 i EECs, och Cd36 kan potentiellt användas för CEC rening.

Sammanfattningsvis beskrivs i det presenterade protokollet den oberoende isoleringen av EECs och Central- och östeuropeiska länder från råtthjärtat. Den omfattande identifieringen av cellulära egenskaper, aktiverad av cellisolering, kan användas för betydande nedströmsprogram.

Materials

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco	15630080	1M
15ml Tubes	Eppendorf	0030122151
50ml Tubes	Nunc	339652
5ml Tubes	Eppendorf	30119401
ACK Lysing Buffer	Gibco	A1049201
Anti-CD31 PE	Miltenyi Biotec	130-115-505
Anti-PE microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Bovine serum albumin (BSA)	Miltenyi Biotec	130-091-376	10%
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-rad	1855485	For qPCR
DNAse I	Worthington	LK 003172	1 mg/mL in water
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10313021
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)	Lonza	CC-3162	EC Medium
Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15575020	0.5 M
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1	Gibco	14025092
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-rad	HSP3805	For qPCR
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368813
Liberase TM	Sigma Aldrich	5401119001	5 mg/mL
MACS LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401	For EC isolation
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-302	For EC isolation
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-rad	MSB1001	For qPCR
Narrow Pattern Forceps	F.S.T	11002-12	For heart harvest
Nylon Sterile Strainer	Falcon	352340	40 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS) X1	Gibco	1001023
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	For qPCR
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1050	For RNA extraction
S&T Forceps – SuperGrip Tips	F.S.T	00632-11	For heart harvest
Strabismus Scissors – Tungsten Carbide	F.S.T	14574-11	For heart harvest
Vannas Spring Scissors – Microserrated	F.S.T	15007-08	For heart harvest