Inducción de lesiones completas de la médula espinal de tipo transección en ratones

Summary

Este protocolo describe cómo crear una laminectomía precisa para la inducción de lesiones medulares estables de tipo transección en el modelo de ratón, con un daño colateral mínimo para la investigación de lesiones de la médula espinal.

Abstract

La lesión de la médula espinal (SCI) conduce en gran medida a la pérdida irreversible y permanente de la función, más comúnmente como resultado de un trauma. Se están investigando varias opciones de tratamiento, como los métodos de trasplante celular, para superar las discapacidades debilitantes derivadas del SCI. La mayoría de los ensayos preclínicos en animales se llevan a cabo en modelos de roedores de SCI. Mientras que los modelos de ratas de SCI han sido ampliamente utilizados, los modelos de ratón han recibido menos atención, a pesar de que los modelos de ratón pueden tener ventajas significativas sobre los modelos de ratas. El pequeño tamaño de los ratones equivale a reducir los costos de mantenimiento animal que para las ratas, y la disponibilidad de numerosos modelos de ratón transgénicos es ventajosa para muchos tipos de estudios. Inducir lesiones repetibles y precisas en los animales es el principal desafío para la investigación de SCI, que en pequeños roedores requiere cirugía de alta precisión. El modelo de lesión de tipo transección ha sido un modelo de lesión de uso común durante la última década para la investigación terapéutica basada en trasplantes, sin embargo, no existe un método estandarizado para inducir una lesión completa de tipo de transección en ratones. Hemos desarrollado un protocolo quirúrgico para inducir una lesión de tipo de transección completa en ratones C57BL/6 a nivel vertebral torácico 10 (T10). El procedimiento utiliza un pequeño taladro de punta en lugar de rongeurs para eliminar con precisión la lámina, después de lo cual se utiliza una hoja delgada con filo de corte redondeado para inducir la transección de la médula espinal. Este método conduce a lesiones reproducibles de tipo transección en pequeños roedores con un daño muscular y óseo colateral mínimo y, por lo tanto, minimiza los factores de confusión, específicamente cuando se analizan los resultados funcionales conductuales.

Introduction

La lesión de la médula espinal (SCI) es un problema médico complejo que resulta en cambios drásticos en la salud y el estilo de vida. No existe una cura para la SCI, y la fisiopatología de sci no se entiende a fondo. Los modelos animal SCI, en particular los modelos de roedores, ofrecen una herramienta invaluable para probar nuevos tratamientos, y se han utilizado para explorar SCI durante décadas. Hasta la fecha, más del 72% de los estudios preclínicos de SCI han empleado modelos de ratas, en comparación con sólo un 16% que han utilizado ratones¹. Aunque las ratas, debido a su mayor tamaño y tendencia a formar caries similares a los ICA humanos, han sido tradicionalmente los animales modelo preferidos para el estudio de nuevos enfoques terapéuticos, los ratones (incluyendo muchos modelos de ratón transgénicos) ahora se utilizan con más frecuencia para estudiar los mecanismos celulares y moleculares del SCI^2. El modelo de ratón ofrece beneficios adicionales en términos de manejo más fácil, tasas de reproducción más rápidas y costos más bajos que las ratas; los ratones también presentan un alto grado de similitud genómica con los seres humanos^1,2,3. La principal desventaja del modelo de ratón se ha identificado como el tamaño significativamente más pequeño que crea desafíos para las intervenciones quirúrgicas para la creación y el tratamiento de lesiones de la médula espinal^4,5.

Hay una brecha en la literatura existente que pone de relieve la necesidad de un protocolo quirúrgico robusto y reproducible para inducir SCI estable en el modelo de ratón. Por lo tanto, proporcionamos un enfoque quirúrgico novedoso y preciso en este protocolo para superar estas limitaciones. Este protocolo proporciona directrices en profundidad para inducir una lesión de tipo transección en ratones, ya que este tipo de lesión ha sido reconocido como el más adecuado para estudiar los cambios regenerativos y degenerativos después de una lesión^6,así como la neuroplasticidad, los circuitos neuronales y los enfoques de ingeniería tisular⁷. Hemos optado por inducir la lesión en la región torácica inferior, ya que el SCI de nivel torácico se utiliza más comúnmente en la literatura¹.

Protocol

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de ética animal de la Universidad Griffith (ESK/04/16 AEC y MSC/04/18 AEC) bajo las directrices del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia. 1. Procedimiento de instalación animal para la cirugía Anestesar y estabilizar al animal. Utilice ratones C57BL/6 hembras de 8 a 10 semanas de edad. Utilice 5% de isoflurano en 1 L/min de oxígeno para la inducción de la anestesia. Para…

Representative Results

El método resultante, tal como se muestra en la Figura 1,implica una estabilización adecuada del ratón (Figura 1A) y una buena visualización de la columna vertebral y el tejido paraspinos (Figura 1B). El proceso espinoso y las láminas se pueden visualizar claramente con una mínima disección muscular y pérdida de sangre(Figura 1C,zona resaltada). La perforación de punta fina se realiza como se m…

Discussion

Este método induce una lesión completa del tipo de transección a nivel vertebral T10 en ratones, lo que resulta en una paraplejia completa del animal, por debajo del nivel de lesión. En general, este método resulta en un sangrado mínimo, daños colaterales insignificantes y una lesión estable y reproducible. En comparación con los métodos de transección publicados anteriormente sin laminectomía^10,este método ofrece los beneficios en términos de visualización directa sin manipular la …

Materials

Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor – 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60×60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material – SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material – Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug