I denne artikel beskrives en protokol med høj overførselshastighed til hurtig og pålidelig bestemmelse af genekspressionsniveauer i enkelt- eller bulk-C. elegans-prøver. Denne protokol kræver ikke RNA-isolering og producerer cDNA direkte fra prøver. Det kan bruges sammen med high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforme.
Dette papir præsenterer en high-throughput omvendt transskription kvantitative PCR (RT-qPCR) analyse for Caenorhabditis elegans, der er hurtig, robust og meget følsom. Denne protokol opnår præcise målinger af genekspression fra enkelte orme eller fra bulkprøver. Protokollen præsenteret her giver en ny tilpasning af eksisterende metoder til supplerende DNA (cDNA) forberedelse koblet til en nanofluidic RT-qPCR platform. Den første del af denne protokol, kaldet ‘Worm-to-CT’, tillader cDNA-produktion direkte fra nematoder uden behov for forudgående mRNA-isolation. Det øger eksperimentel gennemløb ved at tillade forberedelse af cDNA fra 96 orme i 3,5 timer. Den anden del af protokollen bruger eksisterende nanofluidic teknologi til at køre high-throughput RT-qPCR på cDNA. Dette papir evaluerer to forskellige nanofluidic chips: den første kører 96 prøver og 96 mål, hvilket resulterer i 9.216 reaktioner i ca 1,5 dages bænkarbejde. Den anden chiptype består af seks 12 x 12 arrays, hvilket resulterer i 864 reaktioner. Her demonstreres Worm-to-CT-metoden ved at kvantificere mRNA-niveauer af gener, der koder varmechokproteiner fra enkelte orme og fra bulkprøver. Forudsat er en omfattende liste over primere designet til at forstærke forarbejdede RNA for de fleste kodning gener inden for C. elegans genom.
Optimeringen af enkeltcellet RNA-sekventering og qPCR afslørede, at transskriptionelle impulser eller bursts kan føre til massiv variation i antallet af RNA-molekyler pr. celle1. Desuden afdækkede disse teknologier betydelig cellulær heterogenitet, der tidligere blev savnet af standard transskriptionsmålinger. Afhængigt af konteksten er nogle enkeltcellede transskriptionelle variabilitet forårsaget af blandet cellulær sammensætning af væv. Men selv i isogene cellepopulationer dyrket under samme miljø er der udbredt transskriptionel heterogenitet2,3. Denne “biologiske variation” er i stigende grad identificeret som en allestedsnærværende egenskab af cellulære netværk, fra bakterier til mennesker. I nogle tilfælde kan det have fænotypiske konsekvenser i udvikling, kræftprogression, HIV-latenstid og reaktion på kemoterapi4,5.
Nematode Caenorhabditis elegans er en unik modelorganisme med ideelle egenskaber til at studere årsagerne til og konsekvenserne af biologisk variation mellem individer. Disse nematoder er en simpel modelorganisme bestående af 959 celler, og deres gennemsigtige kutikula gør dem modtagelige for in vivo-billeddiagnostiske undersøgelser6. C. elegans er en hermafroditisk art, der overvejende reproducerer gennem selvbefrugtning; dette resulterede i isogene laboratoriestammer. På trods af isogenicitet og kontrollerede kulturforhold er mange fænotyper og udskrifter variable på tværs af individer, hvilket tyder på, at stokastiske eller mikromiljøforskelle bidrager til heterogenitet på tværs af individer7,8. En sådan variation i genekspression har flere fitnesskonsekvenser, herunder variabilitet i mutationernes penetrans, overlevelse, udviklingsmæssig timing og fecundity7,8,9. På grund af disse funktioner giver undersøgelser med en enkelt orm den hidtil usete mulighed for at studere biologisk variation i en hel organisme.
Der er et grundlæggende behov i marken for at udvikle og optimere teknologier til nøjagtig detektion af udskrifter på et enkelt ormniveau. Nye teknologier, såsom enkeltorms-RNA-sekventering10, RNA-sekventering fra isoleret væv11og sekvensering af en enkelt celle12 er nu tilgængelige for C. elegans. Der er dog stadig en stor udfordring: Ved overvågning af interindividualitet falder svagt udtrykte gener ofte under påviselige niveauer13. Dette er især relevant for sjældne udskrifter isoleret fra små mængder udgangsmateriale, da der er et veletableret, omvendt forhold mellem gennemsnitligt udtryk og teknisk varians, hvilket ofte forårsager sjældne udskrifter, der falder under statistiske cutoffs13. Optimeringen af high-throughput multiplexed qPCR teknologier har vist sig nyttig for pattedyr encellede undersøgelser, især når man studerer udtrykket af sjældne udskrifter14,15. Denne teknologi kan også bruges til benchmarking og validering af andre enkeltormsteknologier.
Worm-to-CT er en hurtig, robust metode tilpasset fra et kit, der anvendes i cellebiologi undersøgelser, for enkelt-orm cDNA forberedelse. cDNA opnået ved denne metode kombineret med multiplekseret nanofluidic qPCR-teknologi blev valgt, fordi den giver højere eksperimentel gennemløb, et bredere dynamisk detektionsområde og er blevet valideret til enkeltcelleformål14,15. Det beskrevne cDNA-præparat kan også anvendes sammen med pcr-standardteknologier. Gennemløbet øges på to måder: For det første er cDNA-præparatet hurtigere og mere pålideligt end traditionelt guanidiumthocyanat-phenol-chloroformekstraktion, fordi orme tilsættes direkte til lysisbufferen, hvilket springer direkte isolering af let nedbrydeligt RNA over. For det andet øger brugen af nanofluidiske teknologier betydeligt antallet af prøver og mål, der kan køres samtidigt. I dette papir sammenlignes to chips: en single-array chip og en multi-array chip. En enkelt-array chip kan køre 96 enkelt orme og 96 primer sæt, hvilket resulterer i 9.216 reaktioner pr eksperiment. For at opnå en lignende overførselshastighed ved hjælp af standard qPCR-teknologier ville kræve 96 separate qPCR eksperimenter, ved hjælp af 96 godt plader. Den mindre og mere fleksible multi-array chip består af seks 12 x 12 arrays resulterer i 864 reaktioner. Metodens overlegne pålidelighed og følsomhed forstærkes af nanofluidisk teknologi og af indførelsen af et forforstærkningstrin. Den metode, der præsenteres i dette papir, er beregnet til at blive brugt sammen med en state-of-the-art statistisk algoritme til at udtrække biologisk varians. I denne artikel præsenteres protokollen til hurtig cDNA-forberedelse og qPCR med høj overførselshastighed for både enkeltorms- og batchormeksempler. algoritmen vil blive offentliggjort andetsteds. Til denne protokol skal organiseringen af hver chip forberedes forud for eksperimentet. Tabel 1 og tabel 2 viser eksempler på disse planer for henholdsvis en multi-array og single-array chip. Der er også oversigter over Worm-to-CT-protokollen, der er beskrevet i figur 1, og som kører multi-array- og single-array-chips i Figur 2.
I dette papir har Worm-to-CT-protokollen vist sig at være en hurtig og effektiv metode til at udtrække RNA fra enkelte orme eller en lille gruppe orme. Det nanofluidiske systems høje gennemløb gør det ideelt til kvantificering af målinger af variabilitet mellem de enkelte. Desuden gør denne metodes høje følsomhed det muligt at detektering af gener udtrykt ved lave niveauer, der falder under detektionen, når du bruger RNA-seq-teknologier med en enkelt orm9.
Når man overvejer valget af metode til at forberede cDNA fra enkelt orme. Ly et al.29 optimeret en protokol, der er afhængig af proteinase K for kutikula fordøjelsen. Neglebåndet er en stor forhindring for isolering af molekyler fra orme og proteinase K giver en effektiv metode til at bryde det. Proteinase K skal dog varmeinaktiveres for at kunne bruge enzymer til omvendt transskribering. Mens Ly et al. brugte en 10 minutters eksponering for 96 °C, blev dette trin undgået i denne protokol, fordi RNA er let nedbrydeligt. I stedet for at bruge proteinase K, gentagne fryse-optø cykler blev brugt til at bryde neglebånd. Fryse-optøningen er en effektiv metode til at bryde neglebåndet, fordi mere RNA kan isoleres pr. Orm. Ly et al. rapporterer, at det samlede RNA udvundet pr. orm er 35 ng ved hjælp af proteinase K, mens denne protokol opnår 51,75 ng ± 6,74 SEM af det samlede RNA pr. orm. Undgåelse af varmeeksponering kombineret med forforstærkningstrin udvider tilsyneladende Worm-to-CT’s dynamiske detektionsområde sammenlignet med standardprotokoller. Ly et al. rapport absolutte Ct værdier på 21,1 ± 0,15 for hsp-16,2 og 22,8 ± 0,17 for hsp-70 efter varmechok. Ved hjælp af de samme varmechokforhold (1 h ved 30 °C) opnår denne protokol absolutte Ct-værdier på 17,93 ± 0,57 for hsp-16,2 og 21,13 ±0,33 for hsp-70. Dette indikerer, at fryse-optø lysis-metoden giver højere udbytter af RNA og er mere passende til lavt udtrykte udskrifter.
Nanofluidiske systemer er ideelle, når man undersøger et givet sæt måludskrifter og brugen af enten mindre (multi-array chip) eller større (single-array chip) antal prøver, der giver mulighed for tilpasning til eksperimentets skala. For at få et upartisk billede af alle udskrifter udtrykt i en enkelt orm, er det oplagte valg at bruge RNA-sekventering. Men hvis fokus for eksperimentet er et mindre, men stadig relativt stort sæt målgener, er det mere omkostningseffektivt at bruge denne protokol, forudsat at forskeren har adgang til en nanofluidics PCR-maskine. Omkostningerne ved det nanofluidiske system reagenser og en enkelt-array chip anslås til ca £ 13 per orm, mens omkostningerne ved reagenser til enkelt-orm sekventering ville være ca £ 60 per orm, ikke inklusive sekventering omkostninger.
Når man overvejer, hvilken PCR-platform der skal bruges, giver Worm-to-CT-metoden koblet til nanofluidic qPCR fordele med hensyn til tid og overførselshastighed. Det er muligt at opnå 9.216 RT-qPCR resultater i ca 2 dages arbejde, mens forstærkning af det samme antal mål ved hjælp af en standard qPCR platform ville tage ca 5 arbejdsuger ved hjælp af 96 godt plade assays, der kører fire plader om dagen. Men hvis antallet af mål, der skal testes, er mindre, er det mere omkostningseffektivt at bruge Worm-to-CT kombineret med en standard qPCR-maskine. Single-array-chipsene kan ikke køres igen, så kørsel af tomme brønde reducerer omkostningseffektiviteten.
En begrænsning af metoden er den potentielle dannelse af primer-primer dimers under multiplexing trin, men dette sker i mindre end 1% af tilfældene. Selvom Worm-to-CT-protokollen er effektiv og giver pålidelige resultater, når den anvendes på enkelte orme, er der en fejlrate på ca. 5%, hvilket sandsynligvis svarer til tilfælde, hvor ormen forbliver fanget i hætten eller toppen af røret under høsttrinnet.
Sammen tilbyder denne alsidige og pålidelige metode øget gennemløb og følsomhed sammenlignet med mere standardteknikker. Denne metode kan være meget nyttig til validering af skærme med høj overførselshastighed og er et glimrende valg til enten at overvåge eller validere enkeltorms genekspressionsniveauer. Denne metode kan anvendes på andre udfordrende teknikker, såsom kvantantitation af genekspression fra isolerede væv. For eksempel giver isolering af fulde væv, såsom tarmen, gonader eller celler isoleret af FACs, nok materiale til at udføre RNA-sekventeringseksperimenter. Begrænsede mængder materiale fører dog ofte til duplikerede læsninger, hvilket udelukker kvantantitation af sjældne udskrifter. I dette scenario bør brugen af nanofluidics-baseret teknologi give ekstra følsomhed over for forsøgene og øge omkostningseffektiviteten, hvis forskerne kun skal overvåge en delmængde af alle udskrifter i disse væv eller celler.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Sharlene Murdoch og Babraham Institute Facilities for deres støtte. JLP blev støttet af Wellcome Trust (093970/Z/10/Z), og OC understøttes af ERC 638426 og BBSRC [BBS/E/B000C0426].
100µM stock primers for genes of interest. | |||
20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | for 96.96 chip (Single-Array Chip) |
2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | 100-7611 | |
384 well plates | |||
8-strip PCR tubes | |||
96 well ice block | |||
96 well plates | |||
96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M-96.96 | Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip" |
96-well sealing tape | |||
BioMark & EP1 Software | Fluidigm | 101-6793 | Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software |
BioMark or BioMark HD system | Fluidigm | 100-2451 K1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler" |
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs | Fluidigm | 89000021 | Referenced throughout manuscript as "control line fluid" |
DNA Suspension buffer | TEKnova | T0021 | |
domed PCR caps | |||
Exonuclease I | New England BioLabs | M0293L | |
Exonuclease I reaction buffer | New England BioLabs | B0293S | |
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent | Fluidigm | 100-7673 | referenced throughout manuscript as "sample reagent" |
FLEXsix Gene Expression IFC | Fluidigm | 100-6308 | referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip" |
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide | Fluidigm | 68000088 | This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript. |
IFC Controller MX | Fluidigm | 68000112 I1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine" |
IFC Controllers SOFTWEAR | Fluidigm | 100-2297 | Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX |
liquid nitrogen in dewar | |||
Microcentrifuge | StarLab | C1301B-230V | Used to spin down PCR tube strips in the protocol. |
Nuclease Free Water | |||
plate spinner | Labnet | K4050725 | mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner" |
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit | invitrogen | 4402955 | This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions. |
PreAmp Master Mix | Fluidigm | 100-5580, 100-5581 | |
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions | Fluidigm | 100-6299 | One tube also available for 96 reactions (PN100-6298) |
Rnase Free water | |||
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad Laboratories | 172-5211 | referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix" |
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler | |||
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA | TEKnova | T0224 | Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000031 | Referenced throughout the text as "thermal mixer" |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform" |
Warm water bath |