使用实时细胞分析监测宿主外的流感病毒存活率
Summary
这里报道的是使用实时监测受感染细胞的电阻抗来定量感染性病毒颗粒的方案。通过量化甲型流感病毒在模拟环境条件下的不同物理化学参数下的衰变，提出了该方法的实际应用。
Abstract
病毒颗粒定量方法代表了许多病毒学研究的一个关键方面。尽管存在几种可靠的技术，但它们要么耗时，要么无法检测到微小的变化。这里介绍的是一种通过实时分析受感染细胞的电阻抗变化来精确定量病毒滴度的方案。细胞阻抗是通过位于微孔板中细胞下方的金微电极生物传感器测量的，其大小取决于细胞的数量以及它们的大小和形状。该协议允许以增强的灵敏度实时分析细胞增殖，活力，形态和迁移。还提供了一个实际应用示例，通过量化甲型流感病毒（IAV）的衰变，该病毒随时间推移影响病毒感染性的各种物理化学参数（即温度，盐度和pH值）。对于此类应用，该协议减少了所需的工作量，同时还生成了传染性病毒颗粒的精确定量数据。它允许比较不同IAV之间的失活斜率，这反映了它们在给定环境中的持久化能力。该方案易于执行，具有高度可重复性，可应用于细胞培养中产生细胞病变效应的任何病毒。
Introduction
病毒的传播取决于几个因素的组合。对于环境中分泌的病毒，其传播还取决于在宿主以外的条件下持续存在的能力。因此，一般研究病毒灭活是帮助国家卫生当局和政策制定者实施控制和生物安全措施的关键一步。
在过去十年中，关于病毒在自然环境中和实验室环境中的持久性的知识有了相当大的增加。就甲型流感病毒（IAV）而言，其传播途径使病毒颗粒暴露于各种环境条件。具体而言，它们可以通过1）通过水（即禽类病毒）的粪口途径传播，或2）受污染的污染物以及气溶胶和呼吸道飞沫（即家禽和哺乳动物病毒）直接或间接接触1。在任何情况下，IAV都会受到各种物理化学参数（即pH值，盐度，温度和湿度）的影响，这些参数或多或少会迅速影响其传染性2，3，4，5，6，7，8，9。评估环境因素影响病毒动态以及接触和跨物种传播风险的可能性非常重要，特别是在人畜共患和大流行性病毒方面。
到目前为止，传统的病毒学技术（即通过斑块测定或50%组织培养感染剂量估计测定病毒滴度）已被用于评估IAV感染率随时间推移;但这些技术非常耗时，需要大量耗材10、11、12。使用微电极测量受感染细胞阻抗随时间的变化，是监测不同环境条件下IAV存活率以及一般病毒失活的有用工具。这种方法提供了客观的实时数据，取代了人类对细胞病变效应的主观观察。它可用于确定病毒滴定，从而以较低的置信区间取代传统测量，并避免劳动密集型终点测定。
通过测量细胞阻抗获得的滴定结果与经典斑块测定法或TCID50 方法之间存在线性相关性。因此，通过创建连续稀释病毒的标准曲线，可以使用基于阻抗的滴定方法获得的数据可以很容易地转换为TCID50 或pfu值13，14，15，16，17。使用这种实验方法也可以实现血清样品中存在的中和抗体的检测，定量和功效18，19。最近，基于阻抗的细胞测定已被用于筛选和评估针对Equid甲型疱疹病毒的抗病毒化合物20。
该技术已被用于评估IAV在不同温度下盐水中的持久性，并鉴定IAV血凝素中增加或减少IAV在环境中的持久性的突变21。如果使用传统的滴定方法，这种筛选将需要大量的工作。然而，这种方法可用于任何对细胞形态，细胞数量和细胞表面附着强度有影响的病毒。它还可用于监测各种环境条件下（即在空气中、水中或表面上）的持久性。
此处描述的协议以IAV在水中的生存为例。人类流感病毒在较长时间内暴露于不同的物理化学参数。根据以往结果，选择35 °C盐水（35 g/L NaCl）作为环境模型9。通过细胞感染在不同时间点量化暴露病毒的残留传染性。MDCK细胞是用于IAV扩增的参考细胞类型，接种在涂有微电极传感器的16孔微量滴定板上，并在24小时后被暴露的病毒感染。每15分钟测量一次细胞阻抗，并表示为称为细胞指数（CI）的任意单位。由流感病毒诱导的细胞病变效应，其发病率直接取决于接种到细胞培养物中的感染性病毒颗粒的数量，导致CI降低，随后量化为CIT50 值。该值对应于测量从初始CI减少50%所需的时间（即，在病毒添加之前）。针对多个环境暴露时间计算的 CIT50 值允许在 CIT50 值的线性回归后推断出病毒的失活斜率。
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA是一种基于阻抗的技术，越来越多地用于实时监测细胞特性，如细胞粘附、增殖、迁移和细胞毒性。在这项研究中，通过测量病毒失活斜率证明了该技术在宿主外评估IAV存活的能力。TCID50 和斑块测定等挑剔的技术被细胞活力的客观实时评估所取代，从而反映了病毒诱导的细胞病变效应。与TCID50 或斑块形成单元（pfu）类似，CIT50 也与感染的多重性呈线性相关（<strong class…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
Referências
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
