Overvågning af influenzavirusoverlevelse uden for værten ved hjælp af celleanalyse i realtid
Summary
Rapporteret her er en protokol til kvantificering af infektiøse virale partikler ved hjælp af realtidsovervågning af elektrisk impedans af inficerede celler. En praktisk anvendelse af denne metode præsenteres ved at kvantificere influenza A-virushenfald under forskellige fysisk-kemiske parametre, der efterligner miljøforholdene.
Abstract
Metoder til kvantificering af viruspartikler udgør et kritisk aspekt af mange virologiundersøgelser. Selvom der findes flere pålidelige teknikker, er de enten tidskrævende eller ude af stand til at opdage små variationer. Præsenteret her er en protokol til præcis kvantificering af viral titer ved at analysere elektriske impedansvariationer af inficerede celler i realtid. Cellulær impedans måles gennem guldmikroelektrodebiosensorer placeret under cellerne i mikroplader, hvor størrelsen afhænger af antallet af celler samt deres størrelse og form. Denne protokol tillader realtidsanalyse af celleproliferation, levedygtighed, morfologi og migration med øget følsomhed. Der gives også et eksempel på en praktisk anvendelse ved at kvantificere henfaldet af influenza A-virus (IAV), der er underkastet forskellige fysisk-kemiske parametre, der påvirker viral infektivitet over tid (dvs. temperatur, saltholdighed og pH). For sådanne applikationer reducerer protokollen den nødvendige arbejdsbyrde, samtidig med at der genereres præcise kvantificeringsdata for infektiøse viruspartikler. Det gør det muligt at sammenligne inaktiveringsskråninger mellem forskellige IAV, hvilket afspejler deres evne til at fortsætte i et givet miljø. Denne protokol er let at udføre, er meget reproducerbar og kan anvendes på enhver virus, der producerer cytopatiske virkninger i cellekultur.
Introduction
Overførslen af en virus er afhængig af kombinationen af flere faktorer. For en virus, der udskilles i miljøet, afhænger dens transmission også af evnen til at fortsætte under forhold uden for værten. Undersøgelse af viral inaktivering generelt er derfor et afgørende skridt i retning af at hjælpe de nationale sundhedsmyndigheder og politiske beslutningstagere med at gennemføre kontrol- og biosikkerhedsforanstaltninger.
Viden om viruspersistens i naturlige og laboratoriemæssige omgivelser er steget betydeligt i løbet af det sidste årti. I tilfælde af influenza A-vira (IAV) underkaster deres transmissionsveje virale partikler til en lang række miljøforhold. Specifikt kan de overføres via 1) fækal-orale veje gennem vand (dvs. fuglevirus) eller 2) direkte eller indirekte kontakt med forurenede fomitter samt aerosoler og åndedrætsdråber (dvs. fjerkræ- og pattedyrvirus)1. Under alle omstændigheder underkastes IAV forskellige fysisk-kemiske parametre (dvs. pH, saltholdighed, temperatur og fugtighed), som mere eller mindre hurtigt påvirker deres smitsomhed2,3,4,5,6,7,8,9. Det er af stor betydning, navnlig med hensyn til zoonotiske og pandemiske vira, at vurdere miljøfaktorernes potentiale til at påvirke virusdynamikken og risikoen for eksponering og overførsel på tværs af arter.
Hidtil er traditionelle virologiteknikker (dvs. viral titerbestemmelse gennem plaqueassays eller 50% vævskultur infektiøs dosisestimering) blevet brugt til at vurdere IAV-smitsomhed over tid; men disse teknikker er tidskrævende og kræver mange forsyninger10,11,12. Måling af inficerede celler impedans over tid med mikroelektroder tjener som et nyttigt værktøj til at overvåge IAV-overlevelse under forskellige miljøforhold samt viral inaktivering generelt. Denne metode giver objektive data i realtid, der erstatter subjektiv menneskelig observation af cytopatiske virkninger. Det kan bruges til at bestemme virustitrering og dermed erstatte traditionelle målinger med lavere konfidensintervaller og undgå arbejdskrævende endepunkter.
Der findes en lineær korrelation mellem titreringsresultater opnået ved måling af celleimpedans og ved klassisk plaqueassay eller TCID50-metoder. Derfor kan data opnået med den impedansbaserede titreringsmetode let transformeres i TCID50- eller pfu-værdier ved at oprette en standardkurve med seriel fortynding af virussen13,14,15,16,17. Påvisning, kvantificering og effekt af neutraliserende antistoffer, der er til stede i serumprøver, kan også opnås ved anvendelse af denne eksperimentelle tilgang18,19. For nylig er impedansbaserede cellulære assays blevet brugt til at screene og evaluere antivirale forbindelser mod Equid alphaherpesvirus20.
Denne teknologi er blevet brugt til at evaluere persistensen af IAV’er i saltvand ved forskellige temperaturer og til at identificere mutationer i hæmagglutinin af IAV, der øger eller mindsker IAV-persistens i miljøet21. En sådan screening ville kræve et omfattende arbejde, hvis der anvendes traditionelle titreringsmetoder. Denne metode kan dog bruges til enhver virus, der har indflydelse på cellemorfologi, cellenummer og celleoverfladefastgørelsesstyrke. Det kan også bruges til at overvåge vedholdenhed under forskellige miljøforhold (dvs. i luften, i vand eller på overflader).
Den protokol, der er beskrevet her, anvender IAV-overlevelse i vand som et eksempel. Humane influenzavirus udsættes for forskellige fysisk-kemiske parametre i længere perioder. Saltvand (35 g/l NaCl) vand ved 35 °C blev valgt som miljømodel baseret på tidligere resultater9. Resterende infektivitet af eksponerede vira kvantificeres på forskellige tidspunkter gennem celleinfektion. MDCK-celler, referencecelletypen til IAV-amplifikation, podes på 16 brøndmikrotiterplader belagt med mikroelektrodesensorer og inficeres af eksponerede vira 24 timer senere. Celleimpedans måles hvert 15. minut og udtrykkes som en vilkårlig enhed kaldet celleindekset (CI). Cytopatiske virkninger induceret af influenzavirus, hvis debuthastighed direkte afhænger af antallet af infektiøse virale partikler, der podes til cellekulturen, fører til CI-fald, som efterfølgende kvantificeres som CIT50-værdien . Denne værdi svarer til den tid, der er nødvendig for at måle en reduktion på 50% fra den oprindelige CI (dvs. før virustilsætning). CIT50-værdier beregnet for flere miljøeksponeringstider gør det muligt at fratregne inaktiveringshældningen af et virus efter lineær regression af CIT50-værdier .
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA er en impedansbaseret teknologi, der i stigende grad bruges til realtidsovervågning af celleegenskaber, såsom celleoverholdelse, proliferation, migration og cytotoksicitet. I denne undersøgelse demonstreres denne teknologis evne til at vurdere IAV-overlevelse uden for værten ved at måle virusinaktiveringshældning. Kræsne teknikker som TCID50 og plaque assays erstattes af objektiv realtidsvurdering af cellelevedygtighed, hvilket afspejler cytopatiske virkninger induceret af virussen. I lighed med <s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
Referências
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
