रियल-टाइम सेल विश्लेषण का उपयोग करके मेजबान के बाहर इन्फ्लूएंजा वायरस उत्तरजीविता की निगरानी
Summary
यहां रिपोर्ट की गई है संक्रमित कोशिकाओं के विद्युत प्रतिबाधा की वास्तविक समय की निगरानी का उपयोग करके संक्रामक वायरल कणों के परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल। इस विधि का एक व्यावहारिक अनुप्रयोग पर्यावरणीय परिस्थितियों की नकल करने वाले विभिन्न भौतिक-रासायनिक मापदंडों के तहत इन्फ्लूएंजा ए वायरस क्षय को परिमाणित करके प्रस्तुत किया जाता है।
Abstract
वायरस कण परिमाणीकरण के लिए तरीके कई विषाणु विज्ञान अध्ययनों के एक महत्वपूर्ण पहलू का प्रतिनिधित्व करते हैं। यद्यपि कई विश्वसनीय तकनीकें मौजूद हैं, वे या तो समय लेने वाली हैं या छोटी विविधताओं का पता लगाने में असमर्थ हैं। यहां प्रस्तुत वास्तविक समय में संक्रमित कोशिकाओं की विद्युत प्रतिबाधा विविधताओं का विश्लेषण करके वायरल टिटर के सटीक परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल है। सेलुलर प्रतिबाधा को माइक्रोप्लेट में कोशिकाओं के नीचे स्थित सोने के माइक्रोइलेक्ट्रोड बायोसेंसर के माध्यम से मापा जाता है, जिसमें परिमाण कोशिकाओं की संख्या के साथ-साथ उनके आकार और आकार पर निर्भर करता है। यह प्रोटोकॉल बढ़ी हुई संवेदनशीलता के साथ सेल प्रसार, व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान और प्रवास के वास्तविक समय के विश्लेषण की अनुमति देता है। इसके अलावा प्रदान किया गया इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) के क्षय को निर्धारित करके एक व्यावहारिक अनुप्रयोग का एक उदाहरण है जो समय के साथ वायरल संक्रामकता को प्रभावित करने वाले विभिन्न भौतिक-रासायनिक मापदंडों (यानी, तापमान, लवणता और पीएच) को प्रभावित करता है। इस तरह के अनुप्रयोगों के लिए, प्रोटोकॉल आवश्यक कार्यभार को कम करता है, जबकि संक्रामक वायरस कणों के सटीक परिमाणीकरण डेटा भी उत्पन्न करता है। यह विभिन्न आईएवी के बीच निष्क्रियता ढलानों की तुलना की अनुमति देता है, जो दिए गए वातावरण में बने रहने की उनकी क्षमता को दर्शाता है। यह प्रोटोकॉल करना आसान है, अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य है, और सेल संस्कृति में साइटोपैथिक प्रभाव पैदा करने वाले किसी भी वायरस पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
एक वायरस का संचरण कई कारकों के संयोजन पर निर्भर करता है। पर्यावरण में स्रावित वायरस के लिए, इसका संचरण मेजबान के बाहर की स्थितियों में बने रहने की क्षमता पर भी निर्भर करता है। सामान्य रूप से वायरल निष्क्रियता का अध्ययन करना, इसलिए, राष्ट्रीय स्वास्थ्य अधिकारियों और नीति निर्माताओं को नियंत्रण और जैव सुरक्षा उपायों को लागू करने में मदद करने में एक महत्वपूर्ण कदम है।
प्राकृतिक और प्रयोगशाला सेटिंग्स में वायरस दृढ़ता के बारे में ज्ञान पिछले दशक में काफी बढ़ गया है। इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) के मामले में, उनके संचरण मार्ग पर्यावरणीय स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला में वायरल कणों को प्रस्तुत करते हैं। विशेष रूप से, उन्हें 1) पानी (यानी, एवियन वायरस) के माध्यम से फेकल-मौखिक मार्गों के माध्यम से प्रेषित किया जा सकता है, या 2) दूषित फोमाइट्स द्वारा प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष संपर्क, साथ ही साथ एरोसोल और श्वसन बूंदों (यानी, पोल्ट्री और स्तनधारी वायरस)1। किसी भी मामले में, आईएवी को विभिन्न भौतिक-रासायनिक मापदंडों (यानी, पीएच, लवणता, तापमान और आर्द्रता) के लिए प्रस्तुत किया जाता है, जो कमोबेश तेजी से उनकी संक्रामकता को प्रभावित करता है2,3,4,5,6,7,8,9। यह बहुत महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से जूनोटिक और महामारी वायरस के बारे में, वायरस की गतिशीलता को प्रभावित करने के लिए पर्यावरणीय कारकों की क्षमता और जोखिम और क्रॉस-प्रजाति संचरण के जोखिमों का आकलन करने के लिए।
अब तक, पारंपरिक विषाणु विज्ञान तकनीकों (यानी, पट्टिका assays या 50% ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक अनुमान के माध्यम से वायरल टिटर निर्धारण) का उपयोग समय के साथ आईएवी संक्रामकता का आकलन करने के लिए किया गया है; लेकिन इन तकनीकों में समय लेने वाली हैं और कई आपूर्ति की आवश्यकता होती है10,11,12. माइक्रोइलेक्ट्रोड्स के साथ समय के साथ संक्रमित कोशिकाओं की प्रतिबाधा को मापना विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों में आईएवी अस्तित्व की निगरानी करने के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में कार्य करता है, साथ ही साथ सामान्य रूप से वायरल निष्क्रियता भी। यह विधि उद्देश्य, वास्तविक समय डेटा प्रदान करती है जो साइटोपैथिक प्रभावों के व्यक्तिपरक मानव अवलोकन को प्रतिस्थापित करती है। इसका उपयोग वायरस अनुमापन को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार पारंपरिक मापों को कम आत्मविश्वास अंतराल के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है और श्रम-गहन समापन बिंदु से बचा जा सकता है।
एक रैखिक सहसंबंध सेल प्रतिबाधा के माप और शास्त्रीय पट्टिका परख या TCID50 विधियों द्वारा प्राप्त अनुमापन परिणामों के बीच मौजूद है। इसलिए, प्रतिबाधा-आधारित अनुमापन विधि के साथ प्राप्त डेटा को आसानी से TCID50 या pfu मानों में वायरस 13,14,15,16,17 के सीरियल कमजोर पड़ने के साथ एक मानक वक्र बनाकर परिवर्तित किया जा सकता है। सीरम नमूनों में मौजूद एंटीबॉडी को बेअसर करने की पहचान, परिमाणीकरण और प्रभावकारिता भी इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण 18,19 का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है। हाल ही में, प्रतिबाधा-आधारित सेलुलर assays का उपयोग Equid alphaherpesviruses20 के खिलाफ एंटीवायरल यौगिकों को स्क्रीन और मूल्यांकन करने के लिए किया गया है।
इस तकनीक का उपयोग विभिन्न तापमानों पर खारे पानी में आईएवी की दृढ़ता का मूल्यांकन करने और आईएवी के हेमाग्लूटीनिन में उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए किया गया है जो पर्यावरण में आईएवी दृढ़ता को बढ़ाते हैं या कम करते हैं। पारंपरिक अनुमापन विधियों का उपयोग करते समय इस तरह की स्क्रीनिंग को व्यापक काम की आवश्यकता होगी। हालांकि, इस पद्धति का उपयोग किसी भी वायरस के लिए किया जा सकता है जिसका सेल आकृति विज्ञान, सेल नंबर और सेल सतह अनुलग्नक शक्ति पर प्रभाव पड़ता है। इसका उपयोग विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों (यानी, हवा में, पानी में, या सतहों पर) में दृढ़ता की निगरानी करने के लिए भी किया जा सकता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में पानी में आईएवी अस्तित्व को लागू करता है। मानव इन्फ्लूएंजा वायरस विस्तारित अवधि के दौरान विभिन्न भौतिक-रासायनिक मापदंडों के संपर्क में आते हैं। 35 डिग्री सेल्सियस पर खारा (35 ग्राम / एल NaCl) पानी को पिछले परिणामों के आधार पर पर्यावरण मॉडल के रूप में चुना गया था। उजागर वायरस की अवशिष्ट संक्रामकता को सेल संक्रमण के माध्यम से अलग-अलग समय बिंदुओं पर परिमाणित किया जाता है। MDCK कोशिकाओं, IAV प्रवर्धन के लिए संदर्भ सेल प्रकार, माइक्रोइलेक्ट्रोड सेंसर के साथ लेपित 16 अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेटों पर बीज दिया जाता है और 24 घंटे बाद उजागर वायरस द्वारा संक्रमित होता है। सेल प्रतिबाधा को हर 15 मिनट में मापा जाता है और सेल इंडेक्स (सीआई) नामक एक मनमानी इकाई के रूप में व्यक्त किया जाता है। इन्फ्लूएंजा वायरस द्वारा प्रेरित साइटोपैथिक प्रभाव, जिसकी शुरुआत की दर सीधे कोशिकाओं की संस्कृति के लिए संक्रमित संक्रामक वायरल कणों की संख्या पर निर्भर करती है, सीआई में कमी की ओर ले जाती है, जिसे बाद में सीआईटी 50 मूल्य के रूप में परिमाणित किया जाता है। यह मान प्रारंभिक सीआई से 50% की कमी को मापने के लिए आवश्यक समय से मेल खाता है (यानी, वायरस जोड़ने से पहले)। कई पर्यावरणीय एक्सपोज़र बार के लिए परिकलित CIT50 मानCIT50 मानों के रैखिक प्रतिगमन के बाद वायरस की निष्क्रियता ढलान की कटौती के लिए अनुमति देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA एक प्रतिबाधा-आधारित तकनीक है जिसका उपयोग सेल गुणों की वास्तविक समय की निगरानी के लिए तेजी से किया जाता है, जैसे कि सेल पालन, प्रसार, प्रवास और साइटोटॉक्सिसिटी। इस अध्ययन में, मेजबान के बाहर आईएवी अस्त?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
Referências
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
