リアルタイム細胞解析を用いた宿主外でのインフルエンザウイルスの生存率のモニタリング
Summary
ここで報告されるのは、感染細胞の電気インピーダンスのリアルタイムモニタリングを用いた感染性ウイルス粒子の定量化のためのプロトコルである。この方法の実用的な応用は、環境条件を模倣する異なる物理化学的パラメータ下でのインフルエンザA型ウイルス崩壊を定量化することによって提示される。
Abstract
ウイルス粒子定量のための方法は、多くのウイルス学研究の重要な側面を表しています。いくつかの信頼できる手法が存在しますが、時間がかかるか、小さな変動を検出できません。ここでは、感染細胞の電気インピーダンス変動をリアルタイムで分析することにより、ウイルス力価を正確に定量化するためのプロトコルを紹介します。細胞インピーダンスは、マイクロプレートの細胞の下に位置する金の微小電極バイオセンサを介して測定され、その大きさは細胞の数およびそのサイズおよび形状に依存する。このプロトコルにより、細胞増殖、生存率、形態、および遊走のリアルタイム分析が高感度で可能になります。また、ウイルス感染力に経時的に影響を与える様々な物理化学的パラメータ(すなわち、温度、塩分濃度、pH)に服従するインフルエンザA型ウイルス(IAV)の崩壊を定量化することによって、実用化の例を提供する。このようなアプリケーションの場合、このプロトコルは必要な作業負荷を軽減しながら、感染性ウイルス粒子の正確な定量データを生成します。これにより、異なるIAV間の不活性化スロープの比較が可能になり、特定の環境で持続する能力が反映されます。このプロトコルは、実行が容易であり、再現性が高く、細胞培養において細胞変性効果を産生するあらゆるウイルスに適用することができる。
Introduction
ウイルスの伝播は、いくつかの要因の組み合わせに依存します。環境内で分泌されるウイルスの場合、その感染は、宿主外の条件下で持続する能力にも依存します。したがって、ウイルスの不活性化全般を研究することは、国家保健当局や政策立案者が管理およびバイオセーフティ対策を実施するのに役立つ重要なステップです。
自然環境および実験室環境におけるウイルスの持続性に関する知識は、過去10年間で大幅に増加しました。インフルエンザA型ウイルス(IAV)の場合、その感染経路はウイルス粒子を広範囲の環境条件に服従させる。具体的には、それらは、1)水(すなわち、鳥ウイルス)を通る糞便 – 経口経路、または2)汚染されたフォマイト、ならびにエアロゾルおよび呼吸飛沫(すなわち、家禽および哺乳動物ウイルス)による直接的または間接的な接触を介して伝達され得る1。いずれにせよ、IAVは様々な物理化学的パラメータ(すなわち、pH、塩分濃度、温度、湿度)に服従し、それらは多かれ少なかれそれらの感染力に急速に影響する2、3、4、5、6、7、8、9。特に人獣共通感染症ウイルスやパンデミックウイルスに関しては、ウイルスの動態に影響を与える環境要因の可能性、曝露および種間伝播のリスクを評価することが非常に重要です。
これまでのところ、従来のウイルス学技術(すなわち、プラークアッセイまたは50%組織培養感染用量推定によるウイルス力価決定)は、IAV感染力を経時的に評価するために使用されてきた。しかし、これらの技術は時間がかかり、多くの消耗品を必要とします10,11,12。微小電極を用いて感染細胞のインピーダンスを経時的に測定することは、さまざまな環境条件下でのIAV生存、および一般的なウイルス不活性化を監視するための有用なツールとして役立ちます。この方法は、細胞変性効果の主観的なヒト観察に代わる客観的でリアルタイムのデータを提供する。ウイルス滴定の決定に使用できるため、従来の測定を低い信頼区間に置き換え、労働集約的なエンドポイントアッセイを回避できます。
細胞インピーダンスの測定と古典的なプラークアッセイまたはTCID50法によって得られた滴定結果との間には線形相関が存在する。したがって、インピーダンスベースの滴定法で得られたデータは、ウイルスの段階希釈による標準曲線を作成することでTCID50またはpfu値に容易に変換することができます13,14,15,16,17。血清サンプル中に存在する中和抗体の検出、定量、および有効性も、この実験的アプローチを用いて達成することができる18,19。最近では、インピーダンスベースの細胞アッセイが、Equid alphaherpesvirus20に対する抗ウイルス化合物のスクリーニングおよび評価に使用されています。
この技術は、異なる温度での生理食塩水中のIAVの持続性を評価し、環境中のIAVの持続性を増減させるIAVのヘマグルチニンの変異を特定するために使用されてきました21。このようなスクリーニングは、従来の滴定法を使用する場合、広範な作業を必要とするであろう。しかし、この方法論は、細胞形態、細胞数、および細胞表面付着強度に影響を与える任意のウイルスに使用することができる。また、さまざまな環境条件(空気中、水中、または表面)での持続性を監視するためにも使用できます。
ここで説明するプロトコルは、例として水中でのIAV生存を適用します。ヒトインフルエンザウイルスは、長期間にわたって異なる物理化学的パラメータに曝露される。35°Cの生理食塩水(35g/L NaCl)を環境モデルとして選定した9。暴露されたウイルスの残留感染力は、細胞感染を介して異なる時点で定量化される。IAV増幅の基準細胞型であるMDCK細胞を、マイクロ電極センサーでコーティングした16ウェルマイクロタイタープレート上に播種し、24時間後に暴露されたウイルスに感染させた。セルインピーダンスは15分ごとに測定され、セルインデックス(CI)と呼ばれる任意の単位として表されます。インフルエンザウイルスによって誘導される細胞変性効果は、その発症速度が細胞培養物に接種された感染性ウイルス粒子の数に直接依存し、CI減少をもたらし、続いてCIT50値として定量化される。この値は、初期CIからの50%の減少を測定するのに必要な時間(すなわち、ウイルス添加前)に対応する。いくつかの環境暴露時間について計算されたCIT50値は、CIT50値の線形回帰後のウイルスの不活性化傾きの控除を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCAはインピーダンスベースの技術で、細胞の接着、増殖、遊走、細胞毒性などの細胞特性のリアルタイムモニタリングにますます使用されています。本研究では、宿主外でのIAV生存率を評価するこの技術の能力は、ウイルスの不活化勾配を測定することによって実証される。TCID50やプラークアッセイなどの厳格な技術は、細胞生存率の客観的なリアルタイム評価に置き換えられ、ウ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
Referências
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