Övervakning av influensavirusöverlevnad utanför värden med hjälp av cellanalys i realtid
Summary
Rapporteras här är ett protokoll för kvantifiering av infektiösa viruspartiklar med hjälp av realtidsövervakning av elektrisk impedans av infekterade celler. En praktisk tillämpning av denna metod presenteras genom kvantifiering av influensa A virus sönderfall under olika fysikalisk-kemiska parametrar som efterliknar miljöförhållanden.
Abstract
Metoder för viruspartikelkvantifiering utgör en kritisk aspekt av många virologistudier. Även om det finns flera tillförlitliga tekniker är de antingen tidskrävande eller oförmögna att upptäcka små variationer. Presenteras här är ett protokoll för exakt kvantifiering av viral titer genom att analysera elektriska impedans variationer av infekterade celler i realtid. Cellulär impedans mäts genom guldmikroelektrodbiosensorer som ligger under cellerna i mikroplattor, där storleken beror på antalet celler samt deras storlek och form. Detta protokoll möjliggör realtidsanalys av cellproliferation, livskraft, morfologi och migrering med förbättrad känslighet. Det finns också ett exempel på en praktisk tillämpning genom att kvantifiera sönderfallet av influensa A-virus (IAV) som lämnas in till olika fysikalisk-kemiska parametrar som påverkar virusinfektiviteten över tid (dvs. temperatur, salthalt och pH). För sådana program minskar protokollet den arbets belastning som behövs samtidigt som det genererar exakta kvantifieringsdata för infektiösa viruspartiklar. Det gör det möjligt att jämföra inaktiveringsbackar mellan olika IAV, vilket återspeglar deras förmåga att kvarstå i en given miljö. Detta protokoll är lätt att utföra, är mycket reproducerbart och kan tillämpas på alla virus som producerar cytopatiska effekter i cellkulturen.
Introduction
Överföringen av ett virus beror på kombinationen av flera faktorer. För ett virus som utsöndras i miljön beror dess överföring också på förmågan att kvarstå under förhållanden utanför värden. Att studera viral inaktivering i allmänhet är därför ett avgörande steg för att hjälpa nationella hälsomyndigheter och beslutsfattare att genomföra kontroll- och biosäkerhetsåtgärder.
Kunskapen om virusbeständighet i naturliga och laboratoriemiljöer har ökat avsevärt under det senaste decenniet. När det gäller influensa A-virus (IAV) förs deras överföringsvägar in till viruspartiklar under en rad olika miljöförhållanden. Specifikt kan de överföras via 1) fekal-orala vägar genom vatten (dvs. fågelvirus) eller 2) direkt eller indirekt kontakt med förorenade fomiter, liksom aerosoler och andningsdroppar (dvs. fjäderfä- och däggdjursvirus)1. I vilket fall som helst underkastas IAV olika fysikalisk-kemiska parametrar (dvs. pH, salthalt, temperatur och fuktighet), som mer eller mindre snabbt påverkar deras smittsamhet2,3,4,5,6,7,8,9. Det är av stor betydelse, särskilt när det gäller zoonotiska virus och pandemiska virus, att bedöma miljöfaktorernas potential att påverka virusdynamiken och riskerna för exponering och överföring av arter.
Hittills har traditionella virologitekniker (dvs. viral titerbestämning genom plackanalyser eller 50% vävnadskultur infectious dos estimation) använts för att bedöma IAV-infektionsförmåga över tid; men dessa tekniker är tidskrävande och kräver många förnödenheter10,11,12. Mätning av infekterade celler impedans över tid med mikroelektroder fungerar som ett användbart verktyg för att övervaka IAV överlevnad under olika miljöförhållanden, liksom viral inaktivering i allmänhet. Denna metod ger objektiva realtidsdata som ersätter subjektiv mänsklig observation av cytopatiska effekter. Det kan användas för att bestämma virustitrering, vilket ersätter traditionella mätningar med lägre konfidensintervall och undviker arbetsintensiva slutpunkter analyser.
Det finns en linjär korrelation mellan titreringsresultat som erhålls genom mätning av cellimpedans och genom klassisk plackanalys eller TCID50-metoder. Därför kan data som erhållits med den impedansbaserade titreringsmetoden enkelt omvandlas i TCID50– eller pfu-värden genom att skapa en standardkurva med seriell utspädning av viruset13,14,15,16,17. Detektion, kvantifiering och effekt av neutraliserande antikroppar som finns i serumprover kan också uppnås med detta experimentella tillvägagångssätt18,19. På senare tid har impedansbaserade cellulära analyser använts för att screena och utvärdera antivirala föreningar mot Equid alphaherpesvirus20.
Denna teknik har använts för att utvärdera persistensen av IAV i saltvatten vid olika temperaturer och för att identifiera mutationer i IAV:s hemagglutinin som ökar eller minskar IAV-persistensen i miljön21. En sådan screening skulle kräva omfattande arbete om man använde traditionella titreringsmetoder. Den här metoden kan dock användas för alla virus som påverkar cellmorfologi, cellnummer och cellytans fäststyrka. Det kan också användas för att övervaka persistens under olika miljöförhållanden (dvs. i luften, i vatten eller på ytor).
Protokollet som beskrivs här tillämpar IAV överlevnad i vatten som ett exempel. Humana influensavirus utsätts för olika fysikalisk-kemiska parametrar under längre perioder. Saltvatten (35 g/L NaCl) vid 35 °C valdes som miljömodell baserat på tidigare resultat9. Kvarvarande infektionsförmåga hos exponerade virus kvantifieras vid olika tidpunkter genom cellinfektion. MDCK-celler, referenscelltypen för IAV-förstärkning, sås på 16 väl mikrotiterplattor belagda med mikroelektrodsensorer och infekterade av exponerade virus 24 timmar senare. Cellimpedansen mäts var 15:e minut och uttrycks som en godtycklig enhet som kallas cellindex (CI). Cytopatiska effekter som framkallas av influensaviruset, vars debutfrekvens direkt beror på antalet infektiösa viruspartiklar som inokuleras till cellkulturen, leder till CI-minskning, som därefter kvantifieras som CIT50-värdet . Detta värde motsvarar den tid som krävs för att mäta en 50% minskning från den ursprungliga CI (dvs. före virustillskott). CIT50-värden som beräknats för flera miljöexponeringstider gör det möjligt att göra avdrag för ett viruss inaktiveringsslutning efter linjär regression av CIT50-värden .
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA är en impedansbaserad teknik som i allt högre grad används för realtidsövervakning av cellegenskaper, såsom cellefterlevnad, spridning, migration och cytotoxicitet. I denna studie demonstreras denna tekniks förmåga att bedöma IAV-överlevnad utanför värden genom att mäta virusinaktiveringslutning. Kräsna tekniker som TCID50 och plack analyser ersätts av objektiv realtidsbedömning av cellens livskraft, vilket återspeglar cytopatiska effekter som orsakas av viruset. I likhet med TCID50<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
Referências
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
