Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanarak Konak Dışında Influenza Virüsünün Hayatta Kalmasını İzleme
Summary
Burada, enfekte hücrelerin elektriksel empedansının gerçek zamanlı izlenmesi kullanılarak enfeksiyöz viral parçacıkların ölçülmesi için bir protokol bildirilmektedir. Bu yöntemin pratik bir uygulaması, influenza A virüs çürümesinin çevresel koşulları taklit eden farklı fizikokimyasal parametreler altında ölçülmesiyle sunulmaktadır.
Abstract
Virüs partikül nicelleştirme yöntemleri birçok viroloji çalışmalarının kritik bir yönünü temsil eder. Birkaç güvenilir teknik olmasına rağmen, zaman alıcıdır veya küçük varyasyonları algılayamazlar. Burada sunulan, enfekte hücrelerin elektrik empedans varyasyonlarını gerçek zamanlı olarak analiz ederek viral titerin kesin olarak ölçülmesi için bir protokoldür. Hücresel empedans, hücrelerin altında bulunan ve büyüklüğün hücre sayısına, boyutlarına ve şekillerine bağlı olduğu mikro plakalarda bulunan altın mikroelekrod biyosensörleri ile ölçülür. Bu protokol, hücre çoğalması, canlılık, morfoloji ve göçün gelişmiş hassasiyetle gerçek zamanlı analizine izin verir. Ayrıca, zaman içinde viral enfeksiyöziteyi etkileyen çeşitli fizikokimyasal parametrelere (örneğin, sıcaklık, tuzluluk ve pH) gönderilen influenza A virüsünün (IAV) çürümesini ölçerek pratik bir uygulama örneği de verilmiştir. Bu tür uygulamalar için protokol, enfeksiyöz virüs parçacıklarının hassas nicelik verilerini oluştururken gereken iş yükünü azaltır. Farklı IAV arasında inaktivasyon eğimlerinin karşılaştırılmasını sağlar, bu da belirli bir ortamda devam etme kapasitelerini yansıtır. Bu protokolün gerçekleştirilmesi kolaydır, oldukça tekrarlanabilir ve hücre kültüründe sitopatik etkiler üreten herhangi bir virüse uygulanabilir.
Introduction
Bir virüsün bulaşması çeşitli faktörlerin kombinasyonuna dayanır. Ortamda salgılanan bir virüs için, bulaşması aynı zamanda konak dışındaki koşullarda devam etme yeteneğine de bağlıdır. Genel olarak viral inaktivasyonu incelemek, bu nedenle, ulusal sağlık otoritelerinin ve politika yapıcıların kontrol ve biyogüvenlik önlemlerini uygulamasına yardımcı olmak için çok önemli bir adımdır.
Doğal ve laboratuvar ortamlarında virüs kalıcılığı hakkındaki bilgiler son on yılda önemli ölçüde artmıştır. İnfluenza A virüsleri (IAV) durumunda, bulaşma yolları viral parçacıkları çok çeşitli çevresel koşullara gönderir. Özellikle, 1) dışkı-oral yollar aracılığıyla su yoluyla bulaşabilir (yani kuş virüsleri), veya 2) kontamine fomitlerin yanı sıra aerosoller ve solunum damlacıkları (örneğin, kümes hayvanları ve memeli virüsleri) tarafından doğrudan veya dolaylı temas 1. Her durumda, IAV, enfeksiyozitelerini az çok hızlı bir şekilde etkileyen çeşitli fizikokimyasal parametrelere (örneğin, pH, tuzluluk, sıcaklık ve nem) gönderilir2,3,4,5,6,7,8,9. Özellikle zoonotik ve pandemik virüsler konusunda, çevresel faktörlerin virüs dinamiklerini etkileme potansiyelini ve maruz kalma ve türler arası bulaşma risklerini değerlendirmek büyük önem taşımaktadır.
Şimdiye kadar, geleneksel viroloji teknikleri (yani, plak tahlilleri yoluyla viral titer tayini veya% 50 doku kültürü enfeksiyöz doz tahmini) zaman içinde IAV enfeksiyözlüğü değerlendirmek için kullanılmıştır; ancak bu teknikler zaman alıcıdır ve birçok malzeme gerektirir10,11,12. Enfekte hücrelerin mikroelekrodlarla zaman içinde empedansını ölçmek, genel olarak viral inaktivasyonun yanı sıra farklı çevresel koşullarda IAV sağkalımlarını izlemek için yararlı bir araç olarak hizmet eder. Bu yöntem, sitopatik etkilerin öznel insan gözleminin yerini alan nesnel, gerçek zamanlı veriler sağlar. Virüs titrasyonunu belirlemek, böylece geleneksel ölçümlerin daha düşük güven aralıklarıyla değiştirilmesi ve emek yoğun uç noktaların testlerinden kaçınılması için kullanılabilir.
Hücre empedansının ölçülmesi ile klasik plak tahlil veya TCID50 yöntemleri ile elde edilen titrasyon sonuçları arasında doğrusal bir korelasyon mevcuttur. Bu nedenle empedans bazlı titrasyon yöntemi ile elde edilen veriler, virüsün seri seyreltilmesi ile standart bir eğri oluşturularak TCID50 veya pfu değerlerinde kolayca dönüştürülebilir13,14,15,16,17. Serum örneklerinde bulunan nötralize edici antikorların tespiti, niceliği ve etkinliği de bu deneysel yaklaşım kullanılarak elde edilebilir18,19. Daha yakın zamanda, Equid alphaherpesviruses20’ye karşı antiviral bileşikleri taramak ve değerlendirmek için empedans tabanlı hücresel tahliller kullanılmıştır.
Bu teknoloji, IAAV’lerin tuzlu sudaki kalıcılığını farklı sıcaklıklarda değerlendirmek ve IAV’nin hemagglutinininde ortamdaki IAV kalıcılığını artıran veya azaltan mutasyonları tanımlamak için kullanılmıştır21. Bu tür taramalar, geleneksel titrasyon yöntemlerini kullanıyorsanız kapsamlı bir çalışma gerektirir. Ancak, bu metodoloji hücre morfolojisi, hücre numarası ve hücre yüzeyi bağlanma gücü üzerinde etkisi olan herhangi bir virüs için kullanılabilir. Ayrıca çeşitli çevresel koşullarda (yani havada, suda veya yüzeylerde) kalıcılığı izlemek için de kullanılabilir.
Burada açıklanan protokol örnek olarak suda IAV sağkalımını uygular. İnsan influenza virüsleri uzun süreler boyunca farklı fizikokimyasal parametrelere maruz kalır. 35 °C’de salin (35 g/L NaCl) su, önceki sonuçlara göre çevre modeli olarak seçilmiştir9. Maruz kalan virüslerin artık enfeksiyonu hücre enfeksiyonu yoluyla farklı zaman noktalarında ölçülür. IAV amplifikasyonu için referans hücre tipi olan MDCK hücreleri, mikroelektrod sensörleri ile kaplanmış ve 24 saat sonra maruz kalan virüsler tarafından enfekte edilmiş 16 kuyu mikrotiter plakası üzerinde tohumlanır. Hücre empedansı her 15 dakikada bir ölçülür ve hücre indeksi (CI) adı verilen rastgele bir birim olarak ifade edilir. Başlangıç hızı doğrudan hücre kültürüne aşılanan enfeksiyöz viral parçacıkların sayısına bağlı olan influenza virüsünün neden olduğu sitopatik etkiler, daha sonra CIT50 değeri olarak ölçülen CI azalmasına yol açar. Bu değer, ilk CI’dan %50 azalmayı ölçmek için gereken süreye karşılık gelir (yani, virüs eklemeden önce). Çeşitli çevresel maruz kalma süreleri için hesaplanan CIT50 değerleri, CIT50 değerlerinin doğrusal gerilemesi sonrasında bir virüsün inaktivasyon eğiminin düşür.
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA, hücre yapışması, çoğalma, göç ve sitotoksiklik gibi hücre özelliklerinin gerçek zamanlı izlenmesi için giderek daha fazla kullanılan empedans tabanlı bir teknolojidir. Bu çalışmada, bu teknolojinin IAV sağkalımını konak dışında değerlendirme kapasitesi, virüs inaktivasyon eğimi ölçülerek gösterilmiştir. TCID50 ve plak tahlilleri gibi titiz teknikler, hücre canlılığının objektif gerçek zamanlı değerlendirmesi ile değiştirilir, böylece virüsün neden olduğu si…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
Referências
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
