تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد Ubiquitylation من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A)
Summary
CENP-A في كل مكان هو شرط مهم ل CENP-A ترسب في السنترومير، ورثت من خلال تخمير بين انقسام الخلايا، ولا غنى عنه لقابلية الخلية. هنا نحن وصف تحليل قياس الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A) البروتين.
Abstract
دراسة بنية وديناميكيات الكينتوتشورات و centromeres مهم في فهم عدم استقرار الكروموسومات (CIN) وتطور السرطان. إن كيفية تحديد موقع الكروموسومات ووظيفته لـ “السنترومير” (أي هوية السنترومير) والمشاركة في الفصل الدقيق للكروموسومات هو سؤال أساسي. ويقترح أن يكون مؤشر الحمض النووي غير (علامة وراثية) هوية سنترومير، وCENP-A في كل مكان مطلوب لترسب CENP-A في السنترومير، موروثة من خلال التمدن بين انقسام الخلايا، ولا غنى عنه لقابلية الخلية.
هنا نحن وصف تحليل قياس الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن يتم حث في كل مكان في ليسين مختلفة بسبب وضع علامات EYFP في البروتين المتحول CENP-A K124R. تم تحديد Lysine 306 (K306) في كل مكان في EYFP-CENP-A K124R بنجاح، والذي يتوافق مع الlysine 56 (K56) في CENP-A من خلال تحليل القياس الطيفي الشامل. ويناقش التحذير في استخدام GFP / EYFP أو وضع علامات على ارتفاع الوزن الجزيئي البروتين كأداة لتحليل وظيفة البروتين. كما يناقش الحد التقني الحالي للكشف عن النطاقات في كل مكان، وتحديد كل مكان في كل مكان (ق) محددة، وتصور في كل مكان في الخلايا الحية أو خلية واحدة محددة خلال دورة الخلية بأكملها.
طريقة تحليل قياس الطيف الشامل المعروضة هنا يمكن تطبيقها على البروتين CENP-A البشري مع علامات مختلفة وغيرها من البروتينات centromere-kinetochore. ويمكن التوصية بهذه الطرق الجمعية التي تتكون من عدة مقايسات/تحليلات للباحثين المهتمين بتحديد الأدوار الوظيفية للدمج في كل مكان.
Introduction
في معظم eukaryotes ، يجب أن تلتصق ميكروتيبولس المغزل إلى منطقة واحدة من كل كروموسوم ، يطلق عليه السنترومير. الكينتوشور هو مجمع من البروتينات التي تقع في السنترومير. دراسة توقيت حركات البروتين السنتروميري و kinetochore وبنية kinetochores و centromeres مهم لفهم عدم الاستقرار الكروموسوم (CIN) وتطور السرطان. وتتمثل الأسئلة الرئيسية في كيفية تحديد موقع الكروموسومات ووظيفته لـ “السنترومير” (أي هوية السنترومير) وكيفية مشاركتهم في الفصل الدقيق للكروموسومات. في معظم الأنواع، وجود نواة خاصة تحتوي على بروتين معين يشبه هيستون يسمى CENP-A يحدد هوية السنترومير. ولذلك، يُقترح أن يكون مؤشر CENP-A هو مؤشر غير الحمض النووي (علامة اللاجينية) لهوية الميرومير. من المهم توضيح آلية كيفية تعريف CENP-A لهوية السنترومير في البشر.
إن بروتين التعرف على تقاطع هوليداي (HJURP) هو شابرون CENP-A-محددة الذي يودع CENP-A في نوى 11،2،3. لقد سبق أن ذكرت أن مطلوب CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase لCENP-A في كل مكان على lysine 124 (K124) وتوطين centromere4. كما أن نتائجنا أظهرت أن التوظيف centromere من توليفها حديثا CENP-A يتطلب موجودة من قبل في كل مكان CENP-A5. وهكذا، تم تقديم نموذج يشير إلى أن CENP-A في كل مكان موروثة من خلال التملم بين الانقسامات الخلية.
وعلى النقيض من النتائج التي توصلنا إليها وتلك التي توصلنا إليها، فقد تم نشر النتائج السلبية المتعلقة بـ CENP-A وتوطينها في المنطقة الوسطى مؤخراً6. وادعى المقال أن CENP-A التعديلات على lysine 124 (K124) هي الاستغناء عن إنشاء، وصيانة، وظيفة طويلة الأجل من تينتروميرس الإنسان، استنادا إلى نتائجها السلبية تبين أن طفرة K124R لم تؤثر على CENP-A centrom توطين لا خلية قابلية البقاء6. ومع ذلك، هناك ما يكفي من النقاش في النتائج والاستنتاجات، وقد سبق أن وصفنا ما هي المشكلة التي يمكن أن تكون هناك في نشرتهم السابقة7. وينبغي إيلاء الاهتمام بأنهم تنصهر البروتينات مع CENP-A، التي لديها أوزان جزيئية أكبر بكثير من حجم CENP-A الذاتية: على سبيل المثال، تنصهر ~ 30 كيلو ادا المعزز البروتين الفلورسنت (EYFP) إلى ~ 16 كيلو ادا CENP-A وتحليل EYFP-CENP-A K124R البروتين الانصهار في نظامهم RPE-1CENP-A-/F خروج المغلوب. لا يتوقع أن يرتبط K124 ubiquitin مباشرة إلى HJURP استناداً إلى التنبؤات الهيكلية4، ومع ذلك ، من المتوقع أن يكون لإضافة أحادية ubiquitin تأثير على بروتين التشكل من CENP-A. يمكن تغيير بروتين CENP-A التشكل من خلال وجود بروتين انصهار كبير ، وهذا التغيير التشكلي قد يخفي التغيرات الهيكلية الناجمة عن فقدان في كل مكان. نقترح أن الانصهار من البروتين كبير الحجم يدفع في كل مكان في lysine غير K124 في EYFP -CENP -A K124R متحولة وهذا في كل مكان في موقع آخر يمنع / أقنعة الأصلي K124R نمط ظاهري واحد متحولة. دليل على أن يحدث في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين المتحول K124R CENP-A مع بروتين كبير (EYFP) تم الإبلاغ عنها في نشرتنا السابقة8. ووجد أن علامات EYFP تحفز في كل مكان من موقع ليسين آخر من EYFP -CENP-A K124R وأن EYFP-CENP-A K124R يربط متحولة HJURP. ونتيجة لذلك ، فإن هذا ubiquitylation في موقع آخر يمنع / أقنعة الأصلي K124R الأصلي نمط ظاهري متحولة واحدة ، وكلاهما EYFP – CENP – A WT وK124R المسوخ أظهرت تعريب centromere (استخدمنا وقارنا pBabe – EYFP – CENP – A WT و K124R متحولة ، جنبا إلى جنب مع pBabe – EYFP control.). وأظهرت النتائج أن العلم الموسومة أو غير الموسومة CENP- A K124R المسوخ قاتلة ولكن يمكن إنقاذها من قبل الانصهار monoubiquitin، مما يشير إلى أن CENP-A في كل مكان هو لا غنى عنه لقابلية الخلية.
في السنوات الأخيرة، وضعت العديد من الدراسات المقايسات المختلفة لتحديد التعديلات ما بعد التحويل (PTMs) من البروتين CENP-A والبروتينات المركزية-كينتوشور الأخرى سواء في الجسم الحي وفي المختبر9،10،11. مماثلة ل PTMs من بروتينات هيستون التي هي آلية رئيسية تنظم وظيفة الكروماتين، وتشارك أيضا PTMs من مكونات الكروماتين chromatin centromeric في آلية أساسية لتنظيم الهيكل العام ودالة centromeres. معظم مواقع CENP-A PTM محددة للنيات التي تحتوي على CENP-A، على الرغم من أن يتم حفظ عدد قليل منها في H3، مما يشير إلى أن تعديل هذه المخلفات تساهم في وظيفة centromere محددة. PTMs من CENP-A بما في ذلك الفسفر، أستيليشن، methylation، وفي كل مكان كانت قد ذكرت سابقا9، مما يشير إلى أن CENP-A يتعرض لمجموعة متنوعة من PTMs والمصفوفات الخاصة بهم الجمعي على الدلفين الأمينية وC-terminus هيستون أضعاف المجال. وقد كشفت عن أهمية CENP -A التعديلات في وظائف متعددة من قبل العديد من المجموعات بما في ذلك لنا. وتشمل هذه الوظائف CENP-A ترسب في centromeres، واستقرار البروتين، وتوظيف CCAN (الشبكة المرتبطة centromere التأسيسية)9. ومع ذلك، فإن الدراسات والنتائج المحدودة لـ CENP-A PTMs هي preformed حيث يتم إجراء مقارنات مع واحدة من النغمات الكنسية التي تنظم وظيفتها بشكل مباشر أو غير مباشر. كما أن التقارير التقنية التي تركز على منهجية تحديد هذه التدابير CENP-A PTMs محدودة أيضاً.
لأن CENP-A في كل مكان مطلوب لترسب CENP-A في12سنترومير ، ورثت من خلال dimerization بين انقسام الخلية5، ولا غنى عنه لقابلية الخلية8، فإن طريقة لتحديد CENP -A في كل مكان يكون من الضروري في المستقبل لدراسة النشاط الوظيفي ، وتحديد المواقع ، وهيكل من centromere. ولذلك، هنا نحن وصف تحليل الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن علامات EYFP يدفع في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين CENP-A K124R متحولة8. كما يتم عرض بروتوكولات من المقايسات وغيرها من التحليلات السيطرة (تحليل المناعةfluorescence، محك مستعمرة خارج نمو، وفي التحليل في كل مكان vivo) لمناقشة نتائج التحليل الرئيسي لقياس الطيف الشامل بشكل صحيح.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا وصفنا طرق تحليل القياس الطيفي الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن وضع العلامات EYFP يدفع في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين CENP-A K124R متحولة8. في نتائجنا، نجحنا في تحديد في كل مكان على lysine 306 (K306) في EYFP-CENP-A K124R، وهذا هو المقابلة لايزين 56 (K56) في CENP-A من خلال ت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر تشاو جون لي في مركز أبحاث الحيوانات النموذجي، جامعة نانجينغ لتحليل القياس الطيفي الكتلي. نشكر يانميني دلال، وتاتسو فوكاغاوا، والباحثين الحاليين في مركز أبحاث الحيوانات النموذجي، وجامعة نانجينغ ومعهد أبحاث سرطان الأطفال في غريهي على مناقشتهم المفيدة، والتوجيه التجريبي، والكواشف. نشكر دون و. كليفلاند، دانييلي فاشينيتي، يانميني دلال، مينه بوي، غوستافو دبليو ليون، جون طومسون، لورانس س. كيرشنر، عمروتا أشتيكار، بن إي بلاك، غلينيس أ. لوجسدون، كينجي تاغو، وداون س. تشاندلر على هداياهم السخية من الكواشف. وقد تم دعم Y.N. من قبل مقاطعة جيانغسو ‘مزدوجة – من الدرجة الأولى’ صندوق البناء ، صندوق العلوم الطبيعية لمقاطعة جيانغسو (SBK2019021248)، ومقاطعة جيانغسو 16th ستة صندوق قمم المواهب الكبرى (TD-SWYY-001)، مقاطعة جيانغسو “برنامج المواهب مائة الخبراء الأجانب” صندوق (SBK2019010048)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31970665). وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا من قبل NCI منحة R21 CA205659.
Materials
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | – | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | – | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | – | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | – | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | – | – | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | – | – | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | – | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | – | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | – | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | – | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | – | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | – | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | – | – | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | – | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | – | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | – | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | – | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | – | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | – | Software B2 |
References
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
- Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
- Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
- Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
- Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
- Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
- Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
- Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
- . Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015)
