Massespektrometri analyse til at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)
Summary
CENP-A allestedsnærværendelation er et vigtigt krav til CENP-A deposition på centromere, arvet gennem dimerization mellem celledeling, og uundværlig for celle levedygtighed. Her beskriver vi massespektrometrianalyse for at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-mærket CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.
Abstract
Undersøgelse af strukturen og dynamikken i kinetochores og centromeres er vigtigt at forstå kromosomal ustabilitet (CIN) og kræft progression. Hvordan kromosommal placering og funktion af en centromere (dvs. centromere identitet) bestemmes og deltage i nøjagtig kromosom adskillelse er et grundlæggende spørgsmål. CENP-A foreslås at være ikke-DNA-indikator (epigenetisk mærke) af centromere identitet, og CENP-A allestedsnærværendelation er nødvendig for CENP-A deposition på centromere, arvet gennem dimerization mellem celledeling, og uundværlig for celle levedygtighed.
Her beskriver vi massespektrometrianalyse for at identificere allestedsnærværende allestedsnærværende EYFP-CENP-A K124R-mutant, hvilket tyder på, at allestedsnærværendelation ved en anden lysin induceres på grund af EYFP-mærkningen i CENP-A K124R-proteinet. Lysin 306 (K306) allestedsnærværendelation i EYFP-CENP-A K124R blev identificeret med succes, hvilket svarer til lysin 56 (K56) i CENP-A gennem massespektrometri analyse. En advarsel diskuteres i brugen af GFP / EYFP eller tagging af høj molekylvægt protein som et redskab til at analysere funktionen af et protein. Nuværende tekniske grænse er også drøftet for påvisning af allestedsnærværende bands, identifikation af sted-specifikke allestedsnærværendelation (r), og visualisering af allestedsnærværende i levende celler eller en bestemt enkelt celle i hele celle cyklus.
Metoden til massespektrometri analyse præsenteres her kan anvendes på humane CENP-A protein med forskellige tags og andre centromere-kinetochore proteiner. Disse kombinatoriske metoder, der består af flere analyser/ analyser, kan anbefales til forskere, der er interesseret i at identificere allestedsnærværende roller.
Introduction
I de fleste eukaryoter skal spindelmikrottbuler knyttes til en enkelt region af hvert kromosom, der betegnes som centromere. Kinetochore er et kompleks af proteiner, der er placeret på centromere. Undersøgelse af timingen af centromere og kinetochore protein bevægelser og strukturen af kinetochores og centromeres er vigtigt for at forstå kromosom ustabilitet (CIN) og kræft progression. De centrale spørgsmål er, hvordan kromosommal placering og funktion af en centromere (dvs. centromere identitet) bestemmes, og hvordan de deltager i nøjagtig kromosom adskillelse. I de fleste arter definerer tilstedeværelsen af et særligt nukleososom, der indeholder et specifikt histonlignende protein kaldet CENP-A, centromeres identitet. Det foreslås derfor, at CENP-A er ikke-DNA-indikator (epigenetisk mærke) af centromere identitet. Det er vigtigt at belyse mekanismen for, hvordan CENP-A definerer centromere identitet hos mennesker.
Holliday-krydsgenkendelsesproteinet (HJURP) er den CENP-A-specifikke chaperon , som deponerer CENP-A i centromeric nucleosomes1,2,3. Vi har tidligere rapporteret, at CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase er påkrævet for CENP-A allestedsnærværendelation på lysin 124 (K124) og centromere lokalisering4. Også, vores resultater viste, at centromere rekruttering af nyligt syntetiseret CENP-A kræver allerede eksisterende ubiquitylated CENP-A5. Således blev der fremlagt en model, der antydede, at CENP-A allestedsnærværendelation er nedarvet gennem dimerisering mellem celledivisioner.
I modsætning til vores resultater og yu et al.,, negative resultater vedrørende CENP-A og dens centromeric lokalisering blev for nylig offentliggjort6. Artiklen hævdede, at CENP-A ændringer på lysin 124 (K124) kan undværes til etablering, vedligeholdelse og langsigtet funktion af menneskelige centromeres, baseret på deres negative resultater viser, at mutationen af K124R ikke påvirke CENP-A centromere lokalisering hverken celle levedygtighed6. Der er imidlertid plads nok til debat i deres resultater og konklusioner, og vi har allerede beskrevet, hvilket problem der kunne være i deres tidligere publikation7. Man skal være opmærksom på, at de fusionerede proteiner med CENP-A, som har meget større molekylvægt end størrelsen af endogene CENP-A: fx, de smeltede ~ 30 kDa forbedret gul fluorescerende protein (EYFP) til ~ 16 kDa CENP-A og analyserede EYFP-CENP-A K124R fusion protein i deres RPE-1 CENP-A-/knockout F system. K124 ubiquitin forventes ikke at binde direkte til HJURP baseret på strukturelle forudsigelser4,men tilsætning af mono-ubiquitin forventes at have en indvirkning på protein kropsbygning af CENP-A. Proteinet i CENP-A-kropsbygning kan ændres ved tilstedeværelsen af et stort fusionsprotein, og denne konformationsændring kan maskere de strukturelle ændringer forårsaget af tab af allestedsnærværendelation. Vi foreslår, at fusionen af store protein inducerer allestedsnærværendelation på en anden lysin end K124 i EYFP-CENP-A K124R mutant og denne allestedsnærværendelation på et andet sted hæmmer / masker den oprindelige K124R enkelt mutant fænotype. Der blev rapporteret om dokumentation for, at der forekommer allestedsnærværende allestedsnærværende oplysninger i forskellige lysin i CENP-A K124R-proteinet med et stort tagprotein (EYFP), i vores tidligere publikation8. Det blev konstateret, at EYFP-mærkning fremkalder ubiquitination af et andet lysinsted for EYFP-CENP-A K124R, og at EYFP-CENP-A K124R-mutant binder sig til HJURP. Som følge heraf hæmmer og maskerer denne allestedsnærværendelation på et andet sted den oprindelige K124R-enkelt mutant fænotype, og både EYFP-CENP-A WT og K124R-mutanter viste centromere lokalisering (vi brugte og sammenlignede pBabe-EYFP-CENP-A WT og K124R-mutant sammen med pBabe-EYFP-kontrol.). Resultaterne viste, at flagmærkede eller umærkede CENP-A K124R-mutanter er dødelige, men kan reddes ved en monoubiquitinfusion, hvilket tyder på, at CENP-A allestedsnærværende forholdation er uundværlig for cellernes levedygtighed.
I de senere år har mange undersøgelser udviklet forskellige analyser til identifikation af posttranslationelle modifikationer (PTM’er) af CENP-A-protein og andre centromere-kinetochoreproteiner både in vivo og in vitro9,10,11. Svarende til PTM’er af histon proteiner, der er en vigtig mekanisme, der regulerer funktionen af kromatin, PTM’er af centromeric kromatin komponenter er også involveret i en væsentlig mekanisme til at regulere den overordnede struktur og funktion af centromeres. De fleste CENP-A PTM-anlæg er specifikke for CENP-A-holdige nukleosomer, selv om nogle få af dem er bevaret i histon H3, hvilket tyder på, at ændring af disse restkoncentrationer bidrager til den centromerespecifikke funktion. PTMs af CENP-A herunder fosforylering, acetylation, methylering, og allestedsnærværendelation blev tidligere rapporteret9, hvilket tyder på, at CENP-A er udsat for en række PTM’er og deres kombinatoriske arrays på sin amino endestation og C-terminus histone-fold domæne. Betydningen af CENP-A ændringer i flere funktioner blev afsløret af mange grupper, herunder vores. Disse funktioner omfatter CENP-A deposition på centromeres, protein stabilitet, og rekruttering af CCAN (konstituerende centromere-associerede netværk)9. Begrænsede undersøgelser og resultater af CENP-A-PTM’er er imidlertid præforme, hvor der foretages sammenligninger med en af kanoniske histoner, der direkte eller indirekte regulerer deres funktion. Tekniske rapporter med fokus på metoden til identifikation af disse CENP-A-PTM’er er også begrænsede.
Da CENP-A allestedsnærværendelation er nødvendig for CENP-A deposition på centromere12, arvet gennem dimerization mellem celledeling5, og uundværlig for celle levedygtighed8, metoden til at identificere CENP-A allestedsnærværendelation ville være afgørende i fremtiden at studere den funktionelle aktivitet, positionering, og struktur af centromere. Derfor beskriver vi her massespektrometrianalyse for at identificere allestedsnærværende allestedsnærværende EYFP-CENP-A K124R-mutant, hvilket tyder på, at EYFP-mærkningen fremkalder allestedsnærværende allestedsnærværende i CENP-A K124R-mutantprotein8. Protokoller for andre kontrolanalyser og analyser (immunofluorescensanalyse, analyse af koloniudvækst og in vivo allestedsnærværendelationsanalyse) præsenteres også for at drøfte resultatet af en grundig massespektrometrianalyse korrekt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi metoder til massespektrometri analyse for at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-CENP-A K124R mutant tyder på, at EYFP tagging inducerer allestedsnærværendelation på en anden lysin i CENP-A K124R mutant protein8. I vores resultater identificerede vi med succes allestedsnærværende lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R, der svarer til lysin 56 (K56) i CENP-A gennem massespektrometrianalyse. Massespektrometri analyse beskrevet her er en efterligne metode, som vi tidli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Chao-Jun Li på Model Animal Research Center, Nanjing University for massespektrometri analyse. Vi takker Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa, og nuværende forskere ved Model Animal Research Center, Nanjing University og Greehey Children’s Cancer Research Institute for deres nyttige diskussion, eksperimentel vejledning, og reagenser. Vi takker Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago og Dawn S. Chandler for deres generøse gaver af reagenser. Y.N. blev støttet af Jiangsu-provinsen ”Double- First-Class” Construction Fund, Jiangsu-provinsen Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu-provinsen 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu-provinsen “Foreign Expert Hundred Talents Program” Fund (SBK2019010048) og National Natural Science Foundation i Kina (31970665). Denne undersøgelse blev delvist støttet af NCI-tilskud R21 CA205659.
Materials
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | – | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | – | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | – | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | – | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | – | – | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | – | – | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | – | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | – | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | – | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | – | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | – | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | – | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | – | – | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | – | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | – | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | – | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | – | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | – | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | – | Software B2 |
References
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
- Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
- Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
- Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
- Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
- Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
- Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
- Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
- . Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015)
