ऊतक-विशिष्ट चैपरवन इंटरैक्शन के लिए स्क्रीन करने के लिए कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस का उपयोग करना
Summary
चैपरवन-चैपरोन और चैपरोन-सब्सट्रेट इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए, हम हल्के उत्परिवर्तन या चैपरोन की अधिक अभिव्यक्ति के संयोजन में आरएनए हस्तक्षेप का उपयोग करके कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में सिंथेटिक इंटरैक्शन स्क्रीन करते हैं और ऑर्गेनम स्तर पर ऊतक-विशिष्ट प्रोटीन रोग की निगरानी करते हैं।
Abstract
सेलुलर फंक्शन के लिए प्रोटीन और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की सही तह और असेंबली जरूरी है। कोशिकाएं गुणवत्ता नियंत्रण मार्गों को नियोजित करती हैं जो स्वस्थ प्रोटेओम बनाए रखने के लिए क्षतिग्रस्त प्रोटीन को सही, तनहा या खत्म करते हैं, इस प्रकार सेलुलर प्रोटेओस्टेसिस सुनिश्चित करते हैं और आगे प्रोटीन क्षति को रोकते हैं। प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क के भीतर अनावश्यक कार्यों के कारण, बहुकोशिकीय जीव कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में नॉकडाउन या म्यूटेशन का उपयोग करके पता लगाने योग्य फेनोटाइप के लिए स्क्रीनिंग अधिकांश मामलों में मामूली या कोई फेनोटाइप का पता लगाने में परिणाम होता है। हमने एक विशिष्ट कार्य के लिए आवश्यक चैपरोस की पहचान करने के लिए एक लक्षित स्क्रीनिंग रणनीति विकसित की है और इस प्रकार फेनोटाइप और कार्य के बीच की खाई को पाट दिया है। विशेष रूप से, हम आरएनएआई सिंथेटिक इंटरैक्शन स्क्रीन, नॉक-डाउन चैपरवन अभिव्यक्ति, एक समय में एक चैपरवन का उपयोग करके उपन्यास चैपरवन इंटरैक्शन की निगरानी करते हैं, जानवरों में एक चैपरवन-एन्कोडिंग जीन में उत्परिवर्तन ले जाते हैं या ब्याज की एक चैपरोन को अधिक व्यक्त करते हैं। दो चैपरोनेस को बाधित करके जो व्यक्तिगत रूप से कोई सकल फेनोटाइप प्रस्तुत नहीं करते हैं, हम उन चैपरोनेस की पहचान कर सकते हैं जो दोनों बेफिक्र होने पर एक विशिष्ट फेनोटाइप को बढ़ा या बेनकाब करते हैं। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह दृष्टिकोण एक दिए गए फेनोटाइप से जुड़े प्रोटीन या प्रोटीन परिसरों के तह को मिलाने के लिए एक साथ कार्य करने वाले चैपरोन्स के विशिष्ट सेटों की पहचान कर सकता है।
Introduction
कोशिकाएं गुणवत्ता नियंत्रण मशीनों को नियोजित करके प्रोटीन क्षति का सामना करती हैं जो किसी भी क्षतिग्रस्त प्रोटीन की मरम्मत, तनहा या हटाएं1,2। प्रोटीन परिसरों की तह और असेंबली को आणविक चैपरनेस द्वारा समर्थित किया जाता है, जो अत्यधिक संरक्षित प्रोटीन का एक विविध समूह है जो क्षतिग्रस्तप्रोटीन3,4,5,6, 7की मरम्मत या तनहा कर सकता है। क्षतिग्रस्त प्रोटीन को हटाने की मध्यस्थता सर्वव्यापक-प्रोटीसोम सिस्टम (यूपीएस)8 या ऑटोफैगी मशीनरी9 द्वारा चैपरोन्स10, 11,12के सहयोग से की जाती है। प्रोटीन हो्योस्टोस्टेसिस (प्रोटेओस्टेसिस) इसलिए, तह और क्षरण मशीनों से बना गुणवत्ता नियंत्रण नेटवर्क द्वारा बनाए रखा जाता है3,13। हालांकि, वीवो में प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क के विभिन्न घटकों के बीच बातचीत को समझना एक बड़ी चुनौती है। जबकि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन स्क्रीन शारीरिक बातचीत और चैपरवन कॉम्प्लेक्स14,15पर महत्वपूर्ण जानकारी का योगदान करते हैं, संगठन को समझते हैं और वीवो में ऊतक-विशिष्ट चैपरवन नेटवर्क के भीतर प्रतिपूरक तंत्र की कमी है।
16 , 17,18, 18 , 17 ,18सामान्य या प्रतिपूरक जैविक रास्तों में शामिल जीन के जोड़े के बीच संबंधों की जांच करने के लिए आनुवंशिक बातचीत का उपयोग अक्सर एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कियाजाताहै । इस तरह के संबंधों को उत्परिवर्तन के जोड़े के संयोजन से मापा जा सकता है और दूसरे जीन16में उत्परिवर्तन के कारण होने वाली फेनोटाइपिक गंभीरता पर एक जीन में उत्परिवर्तन के प्रभाव की मात्रा निर्धारित की जा सकती है । जबकि अधिकांश ऐसे संयोजन फेनोटाइप के संदर्भ में कोई प्रभाव नहीं दिखाते हैं, कुछ आनुवंशिक बातचीत या तो बढ़ सकती है या मापा फेनोटाइप की गंभीरता को कम कर सकती है। उत्तेजक उत्परिवर्तन तब देखे जाते हैं जब दोहरे विलोपन उत्परिवर्ती का फेनोटाइप एकल विलोपन म्यूटेंट के संयोजन पर देखे गए अपेक्षित फेनोटाइप की तुलना में अधिक गंभीर होता है, जिसका अर्थ है कि दो जीन समानांतर रास्तों में कार्य करते हैं, एक साथ दिए गए कार्य को प्रभावित करते हैं। इसके विपरीत, म्यूटेशन को समाप्त करने के लिए मनाया जाता है जब डबल विलोपन उत्परिवर्तन का फेनोटाइप एकल विलोपन म्यूटेंट के साथ देखे गए फेनोटाइप की तुलना में कम गंभीर होता है, जिसका अर्थ है कि दोनों जीन एक जटिल के रूप में एक साथ कार्य करते हैं या एक ही मार्ग16,18में भाग लेते हैं। तदनुसार, विविध फेनोटाइप जिनका मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जिनमें व्यापक फेनोटाइप, जैसे घातकता, विकास दर और चिंता का आकार, साथ ही ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर्स जैसे विशिष्ट फेनोटाइप का उपयोग आनुवंशिक बातचीत की पहचान करने के लिए किया गया है । उदाहरण के लिए, जोनिकास एट अल ने सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई ईआर की बातचीत की जांच करने के लिए एक ईआर स्ट्रेस रिपोर्टर पर भरोसा किया, जो जोड़ी के रूप में जीन विलोपन विश्लेषण का उपयोग करके प्रोटीन प्रतिक्रिया प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क सामने आया19।
आनुवंशिक इंटरैक्शन स्क्रीन में डबल म्यूटेंट20का एक व्यापक सेट उत्पन्न करने के लिए व्यवस्थित रूप से जोड़ीवार विलोपन उत्परिवर्तनों को पार करना शामिल है। हालांकि, पशु मॉडल में, और विशेष रूप से सी एलिगेंसमें, यह बड़े पैमाने पर दृष्टिकोण संभव नहीं है। इसके बजाय, उत्परिवर्ती उपभेदों को आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई)21का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को नीचे विनियमित करके उनके आनुवंशिक बातचीत पैटर्न के लिए परीक्षण किया जा सकता है । C. elegans आरएनएआई22, 23पर आधारित स्क्रीन के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है । सी एलिगेंसमें, डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) डिलीवरी बैक्टीरियल फीडिंग द्वारा प्राप्त की जाती है, जिससे डीएसआरएनए अणुओं को कई ऊतकों में फैलता है। इस तरह, पेश किए गए डीएसआरएनए अणु एक त्वरित और सरल प्रक्रिया21के माध्यम से जानवर को प्रभावित करते हैं। इसलिए, आरएनएआई का उपयोग करके एक आनुवंशिक इंटरैक्शन स्क्रीन आरएनएआई पुस्तकालयों24का उपयोग करके जीन या अधिकांश सी एलिगेंस कोडिंग जीन के एक सेट को विनियमित करने के प्रभाव को प्रकट कर सकती है। ऐसी स्क्रीन में, हिट जो ब्याज के उत्परिवर्ती के व्यवहार को प्रभावित करते हैं, लेकिन जंगली प्रकार के तनाव फेनोटाइप के संभावित संशोधकहैं, 25पर नजर रखी जा रही है। यहां, हम सी एलिगेंसमें व्यवस्थित रूप से ऊतक-विशिष्ट चैपरवन इंटरैक्शन को मैप करने के लिए म्यूटेशन और आरएनएआई स्क्रीनिंग का संयोजन लागू करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क की एक एकीकृत तस्वीर जो दर्शाती है कि यह कैसे संगठित है और विभिन्न मेटाज़ोन कोशिकाओं और ऊतकों में कार्यों की कमी बनी हुई है। इस कमी को दूर करने के लिए, विकास और उम्र बढ़ने के दौरान…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कुछ नेमाटोड उपभेदों के लिए एनआईएच नेशनल सेंटर फॉर रिसर्च रिसोर्सेज (एनसीआरआर) द्वारा वित्त पोषित कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर का शुक्रिया अदा करते हैं। एचएफ एपस्टीन द्वारा विकसित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को एनआईसीएचडी के तत्वावधान में विकसित विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त किया गया था और आयोवा विश्वविद्यालय के जीव विज्ञान विभाग द्वारा बनाए रखा गया था। इस शोध को इजराइल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट नंबर 278/18) से अनुदान और इजराइल के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय और विदेश मामलों और अंतरराष्ट्रीय सहयोग मंत्रालय, जनरल डायरेक्टोरेट फॉर कंट्री प्रमोशन, इटैलियन रिपब्लिक (ग्रांट नंबर 3-14337) से अनुदान द्वारा समर्थन दिया गया था । हम इस पांडुलिपि को तैयार करने में मदद के लिए बेन-जावी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 12-well-plates | SPL | BA3D16B | |
| 40 mm plates | Greiner Bio-one | 627160 | |
| 60 mm plates | Greiner Bio-one | 628102 | |
| 6-well plates | Thermo Scientific | 140675 | |
| 96 well 2 mL 128.0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
| Agar | Formedium | AGA03 | |
| Ampicillin | Formedium | 69-52-3 | |
| bromophenol blue | Sigma | BO126-25G | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
| Camera | Qimaging | q30548 | |
| Cholesterol | Amresco | 0433-250G | |
| Confocal | Leica | DM5500 | |
| Filter (0.22 µm) | Sigma | SCGPUO2RE | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ165FC | |
| Glycerol | Frutarom | 2355519000024 | |
| IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
| KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
| MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Gift from the Morimoto laboratory |
| Myosin MHC A (MYO-3) antibody | Hybridoma Bank | 5-6 | |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma | s-0751 | |
| NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
| Peptone | Merck | 61930705001730 | |
| Plate pouring pump | Integra | does it p920 | |
| RNAi Chaperone library | NA | NA | |
| SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
| ß-mercaptoethanol | Bio world | 41300000-1 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Tetracycline | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
| Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 |
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