Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento

Summary

Apresentamos aqui um ensaio de fluorescência sensível para monitorar a atividade da apolipoproteína N-aciltransferase usando peptídeo diacilglicerilo e alquino-fosfolipídios como substratos com click-química.

Abstract

As lipoproteínas de proteobactérias são modificadas pós-translacionalmente por ácidos graxos derivados de fosfolipídios de membrana pela ação de três enzimas integrais de membrana, resultando em proteínas triacilatadas. O primeiro passo na via de modificação da lipoproteína envolve a transferência de um grupo diacilglicerila do fosfatidilglicerol para a prolipoproteína, resultando em prolipoproteína diacilglicerila. Na segunda etapa, o peptídeo de sinal da prolipoproteína é clivado formando uma apolipoproteína, que por sua vez é modificada por um terceiro ácido graxo derivado de um fosfolipídio. Esta última etapa é catalisada pela apolipoproteína N-aciltransferase (Lnt). A via de modificação da lipoproteína é essencial na maioria das γ-proteobactérias, tornando-se um alvo potencial para o desenvolvimento de novos agentes antibacterianos. Descrito aqui é um ensaio sensível para Lnt que é compatível com triagem de alto rendimento de pequenas moléculas inibitórias. A enzima e os substratos são moléculas embutidas na membrana; por conseguinte, o desenvolvimento de um ensaio in vitro não é simples. Isso inclui a purificação da enzima ativa na presença de detergente, a disponibilidade de alquinofosfolipídios e substratos peptídicos diacilglicerilos e as condições de reação em micelas mistas. Além disso, para usar o teste de atividade em uma configuração de triagem de alto rendimento (HTS), a leitura direta do produto da reação é preferida às reações enzimáticas acopladas. Neste ensaio enzimático fluorométrico, o produto peptídico alquino-triacilado é tornado fluorescente através de uma reação de click-chemistry e detectado em um formato de placa multipoço. Este método é aplicável a outras aciltransferases que utilizam substratos contendo ácidos gordos, incluindo fosfolipídios e acil-CoA.

Introduction

As lipoproteínas bacterianas são caracterizadas por ácidos graxos covalentemente ligados em seus amino-termini através dos quais são ancoradas em membranas ^1,2. A parte madura da proteína é altamente diversificada em estrutura e função, explicando assim o papel das lipoproteínas em vários processos biológicos no envelope celular bacteriano.

As lipoproteínas são modificadas por ácidos graxos derivados de fosfolipídios após a inserção na membrana citoplasmática. As prolipoproteínas contêm um motivo de assinatura, a lipocaixa, que contém um resíduo de cisteína invariante que se torna a....

Protocol

1. Preparação de enzimas e substratos

1. Purificação da enzima
   1. Produzir e purificar a enzima Lnt a partir de membranas solubilizadas em detergente, conforme descrito anteriormente ^4,8. Resumidamente, induzir a expressão do gene lnt-strep, codificando Lnt com uma etiqueta Strep C-terminal, a OD 600 de 0,6 com tetraciclina anidra (₂₀₀ ng/mL) a 37 °C por 16 h.
   2. Colher as células por centrifugação a 4.000 x g durante 10 min e descartar o sobrenadante.
   3. Ressuspeite o pellet celular em buffer WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 m....

Results

Na reação Lnt, o ácido graxo sn-1 dos fosfolipídios é transferido para um peptídeo diacilglicerila, resultando em peptídeo triacilado maduro⁸. O ensaio de Lnt in vitro descrito aqui é projetado para usar fosfolipídios contendo um ácido graxo alcino (alquino-POPE) e FSL-1-biotina como substratos, resultando na formação de alquino-FSL-1-biotina. Após uma reação de click-chemistry com azido-FAM, este produto deve ser marcado fluorescentemente e detectado por espectrometria de fluorescência (.......

Discussion

O protocolo para o ensaio de Lnt aqui descrito, baseado na detecção de fluorescência do produto triacilado, é sensível e reprodutível. A ligação específica e eficiente da biotina à estreptavidina é um elemento-chave no ensaio. O substrato Alquino-PAPA deixado após a conclusão da reação Lnt também é marcado fluorescentemente com FAME, mas é eficientemente removido após a ligação às placas de estreptavidina por várias etapas de lavagem. Além disso, a adição de DMSO não afeta a atividade de Lnt e não tem impacto no ensaio. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ä Sistema FPLC Purificador	kta GE Healthcare	NA	Pureza: NA Purificação
Lnt alcino-POPE	Avanti Lipídios Polares	900414P	Pureza: >99% Substrato Lnt
Azido-FAM	Lumiprobe	A4130	Pureza: 100% (puro) Reagente Click
Biofotômetro Plus	Eppendorf	N/A	Pureza: NA OD 600 nm
BioTek ELX 405 Selecione a arruela de placas	BioTek	N° série 115800, n° material 405 Selecione	a pureza: NA Etapas de lavagem
biotina-fluoresceína	Sigma	53608	Pureza: ≥ 90% Controle de fluorescência
Sulfato de cobre(II) pentahidratado	Sigma	C3036	Pureza: ≥ 98% Clique no reagente
DDM	Anatrace	D310A	Pureza: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergente para purificação de Lnt
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Invitrogen	D12435	Pureza: anidro Solbilização Reagente de clique
Pipeta eletrônica Voyager 8 canais 0,5-12,5 uL	INTEGRA	4721	Pureza: NA Manuseio de reagentes
Célula de pressão francesa	N/A	N/A	Pureza: NA Ruptura celular
FSL-1-biotina	Microcoleções EMC	L7030	Pureza: substrato NA Lnt
Greiner Bio-One Microplaca de poliestireno CELLSTAR padrão de 384 poços	Greiner	781091	Pureza: NA Preto com fundo transparente (leitura para cima ou para baixo)
Placa de poliestireno estéril Greiner Bio-One de 96 poços, 655097 de alta ligação	Pureza		: NA Preto com fundo transparente (leitura para cima ou para baixo)
Leitor de microplacas Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Pureza: NA Detecção de fluorescência
MTSES (sódio (2-sulfonatoetil)metantiossulfonato)Anatrace		S110MT	Pureza: ~100% Inibidor específico de tiol
Folhas de vedação adesiva opticamente transparentes	Thermo Scientific	AB-1170	Pureza: NA Folha para selar placa multipoços
Sephacryl S400 HR 16/60 gel coluna de filtração	GE Healthcare	GE28-9356-04	Pureza: NA Lnt purificação
StrepTactin Sepharose 50 %	IBA Biotechnology	2-1201-010	Pureza: NA Lnt purificação
streptavidin	Sigma	S4762-1MG	Pureza: ≥ 13 unidades/mg de proteína Ligação à biotina
TBTA (tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina	Sigma	678937	Pureza: 97% Clique no reagente
TCEP (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina	Sigma	75259	Pureza: ≥ 98% Reagente de clique
TECAN Infinite F500	Tecan	N/A	Pureza: NA Detecção de fluorescência
TECAN Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Pureza: NA Detecção de fluorescência
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	Pureza: NA Tampa aquecida
Triton X-100	Sigma	93443	Pureza: 10% em H2O Tampão de reação Lnt
Ultra centrífuga	Beckman LC	N/A	Pureza: NA Fracionamento celular