Hier beschrijven we een methode voor het genereren van kiemvrije kuikens uit eieren van een commerciële vleeskuikenlijn, de Ross PM3. Deze methode kan worden aangepast voor het genereren van kiemvrije dieren van andere pluimveesoorten.
Studies van de bijdrage van de darmmicrobiota aan de gastheerfysiologie en immunocompetentie worden vergemakkelijkt door de beschikbaarheid van kiemvrije diermodellen, die als de gouden standaard worden beschouwd. Nestelende vogels zijn ideale modellen voor de productie van kiemvrije dieren, omdat het niet nodig is om hun familieleden onder steriele omstandigheden groot te brengen. Kiemvrije kippen worden voornamelijk gegenereerd uit specifiek-pathogeenvrije (SPF) experimentele lijnen, die slecht representatief zijn voor commerciële kippenlijnen. De hier voorgestelde methode maakte de productie van kiemvrije kippen mogelijk uit de snelgroeiende vleeskuikenlijn Ross PM3, die vaak wordt gebruikt door de pluimvee-industrie. Eieren werden snel verzameld na het leggen op een vleeskuikenouderboerderij. Ze ondergingen een strikt ontsmettingsproces van de verzameling tot de introductie in een steriele ei-broedisolator. De kuikens zijn uitgebroed en in deze steriele isolatoren gehouden gedurende de periode die nodig is om hun steriliteit te controleren. Oorspronkelijk ontwikkeld voor een experimentele SPF witte leghorn lijn, is het huidige protocol niet alleen aangepast aan de Ross PM3 vleeskuikenlijn, maar ook aan kwartels. Het is daarom een robuuste en gemakkelijk aan te passen procedure voor andere pluimveesoorten en nestelende vogels van economisch, biologisch of ecologisch belang.
Er is een dramatische toename van de wetenschappelijke en populaire belangstelling voor de bijdrage van de darmmicrobiota aan de diergezondheid. De microbiota, bestaande uit bacteriën, virussen, schimmels en archaea die verschillende niches in de darm van het dier bewonen, is direct of indirect betrokken bij de regulatie van inflammatoire, infectieuze en metabole ziekten die niet alleen zoogdiersoorten treffen, maar ook vee, zoals pluimvee1. Verschillende diermodellen werden ontwikkeld om de bijdrage van de darmmicrobiota aan gezondheid en ziekte beter te bestuderen. Kiemvrije en gnotobiotische dieren maken bijvoorbeeld de studie van de volledige afwezigheid van microben of van een bekende microbiota mogelijk, respectievelijk op de fysiopathologie van infecties 2,3. Het genereren en onderhouden van deze dieren vereist echter gespecialiseerde technieken en faciliteiten, en de kosten, arbeid en vaardigheden die nodig zijn om ze te onderhouden, beperken hun toegang tot veel onderzoekers. Kiemvrije dieren moeten inderdaad regelmatig worden gecontroleerd op mogelijke besmetting met behulp van een combinatie van bacteriekweekmethoden, microscopie, serologie, grove morfologie en op sequencing gebaseerde detectietechnieken. Soortgelijke procedures zijn ook van toepassing op andere soorten, zoals vee, waar dieren over het algemeen groter zijn en grotere faciliteiten nodig hebben voor hun fokkerij en onderhoud, wat tot op zekere hoogte het onderzoek naar de microbiota kan belemmeren.
Pluimvee, meer bepaald kippen, zijn de hoeksteen van de veeteelt wereldwijd, met een kuddepopulatie die meer dan 40 miljard vogels per jaar kan overschrijden. Het is de belangrijkste bron van dierlijke eiwitten ter wereld (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Bovendien zijn er geen culturele of religieuze taboes verbonden aan het fokken of consumeren van kippen. De darmmicrobiota van pluimvee is belangrijk betrokken bij de groei van het dier, de voederconversieverhouding, immuniteit, pathogene resistentie, naast vele andere nutritionele, fysiologische of pathologische processen4. Het genereren van kiemvrije kippen is daarom onmisbaar om de dialoog tussen de microbiota en zijn gastheerte onderstrepen 4. Zelfs als microbiële gemeenschappen de kippenneus5 bewonen, is de inhoud van een ei vers gelegd door een gezonde kip meestal vrij van micro-organismen, de eierschaal en membranen bezitten mechanische barrières om micro-organismeninvasie te voorkomen4. Bovendien worden kuikens gemakkelijk grootgebracht in afwezigheid van hun familieleden, wat, in tegenstelling tot zoogdieren, de productie van kiemvrije dieren mogelijk maakt zonder ouderlijke opfok onder steriele omstandigheden.
De experimentele faciliteit “Infectiology of Farm, Model and Wild Animals” (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Frankrijk, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) maakt deel uit van het Franse nationale infrastructuurnetwerk EMERG’IN (https://www.emergin.fr/). PFIE beheerst de productie van kiemvrije kippen om verschillende experimentele studies uit te voeren gedurende meer dan 40 jaar 7,8,9,10,11. Deze dieren werden geproduceerd uit specifieke pathogeenvrije (SPF) eieren van een witte leghorn leglijn die sinds de jaren 1970 in gesloten fokkerij is grootgebracht. Voornamelijk gebruikt voor microbiologische studies 7,8,9, ervaren kiemvrije vogels een heropleving van interesse met vragen zoals de bijdrage van de darmmicrobiota aan gedrag 13, nutriëntengebruik14, immuunontwikkeling15 en endocriene activiteit. Zelfs als sommige studies zijn gepubliceerd met kiemvrije vleeskuikenlijnen16, blijven deze studies ondervertegenwoordigd in vergelijking met studies met experimentele laaglijnen. De evolutie van wetenschappelijke vragen naar de kruisverwijzing tussen de microbiota en zijn gastheer in de gezondheid en het welzijn van pluimvee heeft ons ertoe gebracht ons historische protocol aan te passen om kiemvrije slachtkuikens van de Ross PM3-lijn te produceren, ‘s werelds meest gebruikte vleeskuikenkippenlijn.
Verschillende methoden om kiemvrije kippen te genereren zijn eerder beschreven 7,21,22. Eenvoudige methoden, zoals die hier worden gepresenteerd, gebruiken verschillende ontsmettingsmiddelen om de bacteriële belasting in het eioppervlak en in de isolatoren te verminderen. De meest gebruikte ontsmettingsmiddelen zijn kwikchloride, quaternair ammonium, joodvorm, natriumhypochloriet en chloordioxide-oplossingen. De resultaten zijn vaak bevredigend. Ondanks de toegankelijkheid van deze methoden kunnen echter maar weinig structuren de methode toepassen en de dieren op grote schaal grootbrengen, waardoor het gebruik van kiemvrije kippen een relatief zeldzame benadering is, alleen gebruikt om zeer specifieke wetenschappelijke vragen aan te pakken. De hier beschreven methoden, materialen en apparatuur maken een zeer efficiënt broedpercentage kiemvrije slachtkuikens mogelijk, die gedurende ten minste 3 weken gezond en steriel blijven (de duur van de wetenschappelijke experimenten waarvoor ze zijn geproduceerd).
De resultaten tonen aan dat de aanpassing van het protocol aan de productie van kiemvrije kuikens uit eieren verzameld in commerciële pluimveebedrijven succesvol is. De ervaring met de productie van SPF-eieren leert dat de efficiëntie van het uitkomen voornamelijk afhangt van de leeftijd van de leghennen en van de kwaliteit van de verzamelde eieren. Beide parameters werden in aanmerking genomen bij de keuze van boerderijen en de eieren. Met dezelfde methode is de gemiddelde broedsnelheid van kiemvrije slachtkuikens veel beter dan die verkregen bij de laatste productie van SPF-leghennen in onze faciliteit (79% versus 35%), zonder de steriliteit van dieren te beïnvloeden (87% versus 83%). Deze verschillen kunnen verband houden met de genetische achtergrond van de vogels (slachtkuikens versus leghennen) en met de kwaliteit van de eierschaal, die waarschijnlijk kwetsbaarder is in de eieren van de SPF-dieren, die meer dan 40 jaar in gesloten fokkerij worden gehouden. Bovendien laten we ook zien dat transport van meer dan 2 uur (van de bedrijven naar de experimentele faciliteit) geen invloed heeft op de efficiëntie en kwaliteit van het broeden.
Hoewel het sterilisatieproces dat wordt gebruikt voor het uitkomen van isolatoren en het protocol voor het ontsmetten van eieren zijn geoptimaliseerd, was ongeveer 10% van de isolatoren niet kiemvrij. Om de oorsprong van de besmetting te begrijpen, is het erg belangrijk om routinematige steriliteitscontrole van de uitgekomen isolatoren uit te voeren voordat het ei wordt binnengebracht.
Met betrekking tot de steriliteitsstatus van de vogels hebben we geprobeerd methoden toe te passen die de groei van aërobe en niet-kieskeurige anaerobe bacteriën uit fecale monsters mogelijk maken, waardoor we ervoor zorgen dat we levende, levensvatbare bacteriën detecteren. Deze methoden voldoen aan internationale farmacopees voor steriliteitstests en vertegenwoordigen snelle, eenvoudige en kostenbesparende technieken die routinematig kunnen worden gebruikt. Moleculair biologische technieken zoals 16S rRNA-gensequencing, hoewel ze geen informatie geven over de levensvatbaarheid van bacteriën, kunnen echter worden toegepast voor de bevestiging van de aanwezigheid van niet-cultivbare bacteriën. Inderdaad, een recente studie suggereerde dat sommige bacteriën van de maternale eileidermicrobiota via het eiwit naar het embryo lijken te worden overgebracht, later het grootste deel van de embryonale darmbacteriepopulatievormen 5. Bovendien suggereerde een andere studie dat een deel van de microbiële kolonisatoren in vroege embryo’s werden geërfd van maternale kippen, en de darm microbiële overvloed en diversiteit werden later beïnvloed door omgevingsfactoren en gastheergenetica tijdens de ontwikkeling23. De resultaten van deze studies zijn echter gebaseerd op DNA-sequentieanalyse, waarbij een groot aantal van die bacteriën dood zou kunnen zijn of niet repliceerbaar in het eiwit (sterk geladen met antimicrobiële moleculen). Thomas en medewerkers16 voerden steriliteitstests uit door de beoordeling van cultivable aerobe en facultatieve aerobe bacteriën door fecale dropping op BHI-platen, waardoor de efficiëntie van standaard bacteriologische methoden voor kiemvrije steriliteitscontrole werd benadrukt. Bovendien gebruikten we in het voorgestelde protocol groeimonitoring in thioglycolaatbouillon met resazurine om de groei van niet-kieskeurige anaerobe bacteriën te kunnen detecteren.
Het protocol, dat al wordt gebruikt voor de productie van kiemvrije kwartels en kippen, is aanpasbaar aan de productie van kiemvrije dieren van de meeste broedende vogels en biedt perspectieven voor de studie van de bijdrage van de microbiota aan de fysiologie van deze dieren. Naast het gebruik van dit model om de onderlinge interacties tussen gastheer en microbiota in de pluimveebuik te onderzoeken, kan het ook nuttig zijn voor toegepast onderzoek. Het kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de veiligheid en werkzaamheid van probiotica afgeleid van commensale micro-organismen van kippendarm te beoordelen om de gezondheid en robuustheid van dieren te verbeteren.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn de fokkers en de vereniging Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Frankrijk) dankbaar voor de levering van bevruchte eieren. Deze studie werd uitgevoerd onder auspiciën van het onderzoeksconsortium APR-IA ‘INTEGRITY’ (2017-2019), dat werd gefinancierd door het Région Centre Val de Loire, Frankrijk.
2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
50 mL tubes | Falcon | ||
BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
Pipette aid | Drummond | ||
Plastic pipettes | |||
Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |