Hier beschreiben wir eine Methode zur Erzeugung keimfreier Küken aus Eiern einer kommerziellen Masthähnchenlinie, der Ross PM3. Diese Methode kann für die Erzeugung keimfreier Tiere aus anderen Geflügelarten angepasst werden.
Untersuchungen des Beitrags der Darmmikrobiota zur Wirtsphysiologie und Immunkompetenz werden durch die Verfügbarkeit keimfreier Tiermodelle erleichtert, die als Goldstandard gelten. Nistende Vögel sind ideale Modelle für die Produktion keimfreier Tiere, da ihre Verwandten nicht unter sterilen Bedingungen aufgezogen werden müssen. Keimfreie Hühner werden hauptsächlich aus spezifisch-pathogenfreien (SPF) Versuchslinien erzeugt, die für kommerzielle Hühnerlinien schlecht repräsentativ sind. Die hier vorgeschlagene Methode ermöglichte die Produktion von keimfreien Hühnern aus der schnell wachsenden Masthähnchenlinie Ross PM3, die üblicherweise von der Geflügelindustrie verwendet wird. Die Eier wurden schnell gesammelt, nachdem sie auf einer Masthähnchenzuchtfarm gelegt worden waren. Sie durchliefen einen strengen Dekontaminationsprozess von der Entnahme bis zur Einführung in einen sterilen Eierschlüpfisolator. Die Küken wurden geschlüpft und in diesen sterilen Isolatoren während des Zeitraums gehalten, der zur Kontrolle ihrer Sterilität erforderlich ist. Ursprünglich für eine experimentelle SPF-Linie für weiße Leghorne entwickelt, wurde das vorliegende Protokoll nicht nur an die Ross PM3-Masthähnchenlinie, sondern auch an Wachteln angepasst. Es stellt daher ein robustes und leicht anpassbares Verfahren an andere Geflügelarten und Brutvögel von ökonomischer, biologischer oder ökologischer Relevanz dar.
Das wissenschaftliche und populäre Interesse am Beitrag der Darmmikrobiota zur Tiergesundheit hat dramatisch zugenommen. Die Mikrobiota, bestehend aus Bakterien, Viren, Pilzen und Archaeen, die verschiedene Nischen im Darm des Tieres bewohnen, ist direkt oder indirekt an der Regulation von entzündlichen, infektiösen und metabolischen Erkrankungen beteiligt, die nicht nur Säugetierarten, sondern auch Nutztiere wie Geflügelbetreffen 1. Mehrere Tiermodelle wurden entwickelt, um den Beitrag der Darmmikrobiota zu Gesundheit und Krankheit besser untersuchen zu können. Zum Beispiel ermöglichen keimfreie und gnotobiotische Tiere die Untersuchung der vollständigen Abwesenheit von Mikroben bzw. einer bekannten Mikrobiota auf die Physiopathologie von Infektionen 2,3. Die Erzeugung und Pflege dieser Tiere erfordert jedoch spezielle Techniken und Einrichtungen, und die Kosten, die Arbeit und die Fähigkeiten, die erforderlich sind, um sie zu erhalten, beschränken ihren Zugang zu vielen Forschern. Tatsächlich müssen keimfreie Tiere regelmäßig auf eine mögliche Kontamination mit einer Kombination aus Bakterienkultivierungsmethoden, Mikroskopie, Serologie, grober Morphologie und sequenzierungsbasierten Nachweistechniken überwacht werden. Ähnliche Verfahren gelten auch für andere Arten wie Nutztiere, bei denen Tiere im Allgemeinen größer sind und größere Einrichtungen für ihre Zucht und Pflege benötigen, was die Erforschung der Mikrobiota bis zu einem gewissen Grad behindern kann.
Geflügel, genauer gesagt Hühner, sind der Eckpfeiler der weltweiten Tierproduktion, mit einer Herdenpopulation, die 40 Milliarden Vögel pro Jahr überschreiten kann. Es ist die wichtigste Quelle für tierisches Protein in der Welt (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Darüber hinaus gibt es keine kulturellen oder religiösen Tabus, die mit der Aufzucht oder dem Verzehr von Hühnern verbunden sind. Die Geflügeldarmmikrobiota ist wichtig am Wachstum der Tiere, am Futterverwertungsverhältnis, an der Immunität, an der Resistenz gegen Krankheitserreger und an vielen anderen ernährungsphysiologischen, physiologischen oder pathologischen Prozessenbeteiligt 4. Die Erzeugung keimfreier Hühner ist daher unerlässlich, um den Dialog zwischen der Mikrobiota und ihrem Wirt zu unterstreichen4. Selbst wenn mikrobielle Gemeinschaften den Huhneileiter5 bewohnen, ist der Inhalt eines Eies, das von einer gesunden Henne frisch gelegt wurde, meist frei von Mikroorganismen, wobei die Eierschale und die Membranen mechanische Barrieren besitzen, um eine Invasion von Mikroorganismen zu vermeiden4. Darüber hinaus werden Küken in Abwesenheit ihrer Verwandten leicht aufgezogen, was im Gegensatz zu Säugetieren die Produktion keimfreier Tiere ohne elterliche Aufzucht unter sterilen Bedingungen ermöglicht.
Die Versuchsanlage “Infektiologie von Nutztieren, Modellen und Wildtieren” (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Frankreich, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) ist Teil des französischen nationalen Infrastrukturnetzes EMERG’IN (https://www.emergin.fr/). PFIE beherrscht die Produktion von keimfreien Hühnern, um seit mehr als 40 Jahren verschiedene experimentelle Studien durchzuführen 7,8,9,10,11. Diese Tiere wurden aus spezifischen pathogenfreien (SPF) Eiern einer weißen Leghorn-Legelinie hergestellt, die seit den 1970er Jahren in geschlossener Zucht gezüchtet wurde. Hauptsächlich für mikrobiologische Studien verwendet 7,8,9, erleben keimfreie Vögel ein Wiederaufleben des Interesses mit Fragen wie dem Beitrag der Darmmikrobiota zum Verhalten 13, Nährstoffverwertung 14, Immunentwicklung 15 und endokriner Aktivität. Auch wenn einige Studien mit keimfreien Masthähnchenlinien16 veröffentlicht wurden, bleiben diese Studien im Vergleich zu Studien mit experimentellen Schichtlinien unterrepräsentiert. Die Entwicklung wissenschaftlicher Fragen hin zum Crosstalk zwischen der Mikrobiota und ihrem Wirt in Bezug auf Geflügelgesundheit und -wohlergehen hat uns dazu veranlasst, unser historisches Protokoll anzupassen, um keimfreie Masthähnchen der Ross PM3-Linie, der weltweit am häufigsten verwendeten Masthähnchenlinie, herzustellen.
Mehrere Methoden zur Erzeugung keimfreier Hühner wurden zuvor beschrieben 7,21,22. Einfache Methoden, wie die hier vorgestellte, verwenden verschiedene Desinfektionsmittel, um die Keimbelastung in der Eioberfläche und in den Isolatoren zu reduzieren. Die am häufigsten verwendeten Desinfektionsmittel sind Quecksilberchlorid, quartäres Ammonium, Jodform, Natriumhypochlorit und Chlordioxidlösungen. Die Ergebnisse sind oft zufriedenstellend. Trotz der Zugänglichkeit dieser Methoden können jedoch nur wenige Strukturen die Methode anwenden und die Tiere in großem Maßstab aufziehen, was die Verwendung keimfreier Hühner zu einem relativ seltenen Ansatz macht, der nur zur Beantwortung sehr spezifischer wissenschaftlicher Fragen verwendet wird. Die hier beschriebenen Methoden, Materialien und Geräte ermöglichen einen hocheffizienten Schlüpfanteil keimfreier Masthähnchen, die mindestens 3 Wochen (die Dauer der wissenschaftlichen Experimente, zu denen sie hergestellt wurden) gesund und steril bleiben.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Anpassung des Protokolls an die Produktion keimfreier Küken aus Eiern, die in kommerziellen Geflügelfarmen gesammelt wurden, erfolgreich ist. Die Erfahrung mit der SPF-Eierproduktion zeigt, dass die Schlupfeffizienz in erster Linie vom Alter der Legehennen und von der Qualität der gesammelten Eier abhängt. Beide Parameter wurden bei der Auswahl der Betriebe und der Sammlung der Eier berücksichtigt. Mit der gleichen Methode ist die durchschnittliche Schlüpfrate von keimfreien Masthähnchen viel besser als bei der letzten Produktion von SPF-Legehennen in unserer Anlage (79% gegenüber 35%), ohne die Tiersterilität zu beeinträchtigen (87% vs. 83%). Diese Unterschiede können mit dem genetischen Hintergrund der Vögel (Masthähnchen versus Schichten) sowie mit der Qualität der Eierschale zusammenhängen, die in den Eiern der SPF-Tiere, die seit mehr als 40 Jahren in geschlossener Zucht gehalten werden, anfälliger ist. Darüber hinaus zeigen wir auch, dass der Transport von mehr als 2 h (von den Farmen zur Versuchsanlage) die Schlupfeffizienz und -qualität nicht beeinträchtigt.
Obwohl der Sterilisationsprozess für Schlüpfisolatoren und das Protokoll für die Eizelldekontamination optimiert wurden, waren rund 10% der Isolatoren nicht keimfrei. Um den Ursprung der Kontamination zu verstehen, ist es sehr wichtig, eine routinemäßige Sterilitätskontrolle der geschlüpften Isolatoren vor der Eieinführung durchzuführen.
In Bezug auf den Sterilitätsstatus der Vögel haben wir versucht, Methoden anzuwenden, die das Wachstum von aeroben und nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien aus Stuhlproben ermöglichen und so sicherstellen, dass wir lebende, lebensfähige Bakterien nachweisen. Diese Methoden entsprechen den internationalen Arzneibüchern für Sterilitätstests und stellen schnelle, einfache und kostenreduzierte Techniken dar, die routinemäßig angewendet werden können. Molekularbiologische Techniken wie die 16S rRNA-Gensequenzierung geben zwar keine Informationen über die Lebensfähigkeit von Bakterien, können jedoch zur Bestätigung des Vorhandenseins nicht kultivierbarer Bakterien eingesetzt werden. Tatsächlich deutete eine kürzlich durchgeführte Studie darauf hin, dass einige Bakterien der mütterlichen Eileitermikrobiota durch das Eiweiß auf den Embryo übertragen zu werden scheinen und später den größten Teil der embryonalen Darmbakterienpopulationausmachen 5. Darüber hinaus deutete eine andere Studie darauf hin, dass ein Teil der mikrobiellen Kolonisatoren, die in frühen Embryonen untergebracht waren, von mütterlichen Hühnern vererbt wurden und die mikrobielle Häufigkeit und Vielfalt des Darms später durch Umweltfaktoren und Wirtsgenetik während der Entwicklungbeeinflusst wurden 23. Die Ergebnisse dieser Studien basieren jedoch auf DNA-Sequenzanalysen, bei denen eine große Anzahl dieser Bakterien im Eiweiß (stark mit antimikrobiellen Molekülen beladen) tot oder nicht replizierbar sein könnte. Thomas und seine Mitarbeiter16 führten Sterilitätstests durch die Bewertung kultivierbarer aerober und fakultativer aerober Bakterien durch fäkales Abtropfen auf BHI-Platten durch und hoben so die Effizienz der bakteriologischen Standardmethoden zur keimfreien Sterilitätskontrolle hervor. Darüber hinaus haben wir in dem vorgeschlagenen Protokoll die Wachstumsüberwachung in Thioglycolatbrühe mit Resazurin verwendet, um das Wachstum von nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien nachweisen zu können.
Das Protokoll, das bereits für die Produktion von keimfreien Wachteln und Hühnern verwendet wird, ist an die Produktion von keimfreien Tieren aus den meisten Brutvögeln anpassbar und bietet Perspektiven für die Untersuchung des Beitrags der Mikrobiota zur Physiologie dieser Tiere. Neben der Verwendung dieses Modells zur Untersuchung gegenseitiger Interaktionen zwischen Wirt und Mikrobiota im Geflügeldarm könnte es auch für die angewandte Forschung nützlich sein. Zum Beispiel könnte es verwendet werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit von Probiotika aus Hühnerdarm-kommensalen Mikroorganismen zu bewerten, um die Gesundheit und Robustheit der Tiere zu verbessern.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken den Züchtern und dem Verein Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Frankreich) für die Lieferung von befruchteten Eiern. Diese Studie wurde unter der Schirmherrschaft des Forschungskonsortiums APR-IA “INTEGRITY” (2017-2019) durchgeführt, das vom Région Centre Val de Loire, Frankreich, finanziert wurde.
2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
50 mL tubes | Falcon | ||
BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
Pipette aid | Drummond | ||
Plastic pipettes | |||
Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |