כאן אנו מתארים שיטה ליצירת אפרוחים ללא חיידקים מביצים של קו ברוילר מסחרי, Ross PM3. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לדור של בעלי חיים ללא חיידקים ממיני עופות אחרים.
מחקרים על תרומת המיקרוביוטה של המעיים לפיזיולוגיה של המארח ולתכשירות חיסונית מתאפשרים הודות לזמינותם של מודלים של בעלי חיים נטולי חיידקים, הנחשבים לתקן הזהב. ציפורי קינון הן מודלים אידיאליים לייצור בעלי חיים ללא חיידקים, שכן אין צורך לגדל את קרוביהם בתנאים סטריליים. תרנגולות ללא חיידקים מופקות בעיקר מקווי ניסוי ספציפיים-נטולי פתוגנים (SPF), המייצגים בצורה גרועה קווי עוף מסחריים. השיטה שהוצעה כאן אפשרה ייצור של תרנגולות ללא חיידקים מקו הברוילרים הגדל במהירות רוס PM3, המשמש בדרך כלל את תעשיית העופות. הביצים נאספו במהירות לאחר הטלתן בחוות מגדלי תותחים. הם עברו תהליך טיהור קפדני מהאוסף ועד להקדמה בבידוד בקיעת ביצים סטרילי. האפרוחים בקעו ונשמרו במבודדים סטריליים אלה בתקופה הדרושה כדי לשלוט בעקרותם. הפרוטוקול הנוכחי, שפותח במקור עבור קו קרניים לבנים ניסיוני עם SPF, הותאם לא רק לקו ה-Ross PM3 broiler אלא גם לשליו. לפיכך הוא מייצג הליך חזק וניתן להתאמה בקלות למיני עופות אחרים ולציפורים מקננות בעלות רלוונטיות כלכלית, ביולוגית או אקולוגית.
חלה עלייה דרמטית בהתעניינות המדעית והפופולרית בנוגע לתרומתה של המיקרוביוטה של המעיים לבריאות בעלי החיים. המיקרוביוטה, המורכבת מחיידקים, וירוסים, פטריות וארכיאה המאכלסים נישות שונות במעי החיה, מעורבת במישרין או בעקיפין בוויסות של מחלות דלקתיות, זיהומיות ומטבוליות המשפיעות לא רק על מיני יונקים אלא גם על בעלי חיים, כגון עופות1. מספר מודלים של בעלי חיים פותחו כדי לחקור טוב יותר את התרומה של המיקרוביוטה של המעיים לבריאות ולמחלות. לדוגמה, בעלי חיים נטולי חיידקים וגנוטוביוטים מאפשרים לחקור את היעדרם המוחלט של מיקרובים או של מיקרוביוטה ידועה, בהתאמה, על הפיזיופתולוגיה של זיהומים 2,3. עם זאת, יצירה ותחזוקה של בעלי חיים אלה דורשת טכניקות ומתקנים מיוחדים, והעלויות, העבודה והכישורים הנדרשים כדי לתחזק אותם מגבילים את גישתם לחוקרים רבים. ואכן, בעלי חיים ללא חיידקים חייבים להיות מנוטרים באופן קבוע לאיתור זיהום אפשרי באמצעות שילוב של שיטות גידול חיידקים, מיקרוסקופיה, סרולוגיה, מורפולוגיה גסה וטכניקות זיהוי מבוססות ריצוף. נהלים דומים חלים גם על מינים אחרים, כגון בעלי חיים, שבהם בעלי החיים בדרך כלל גדולים יותר ודורשים מתקנים גדולים יותר לצורך הרבייה והתחזוקה שלהם, מה שעלול לעכב, במידה מסוימת, את המחקר על המיקרוביוטה.
עופות, ליתר דיוק תרנגולות, הם אבן הפינה של ייצור בעלי חיים ברחבי העולם, עם אוכלוסיית להקות שעשויה לעלות על 40 מיליארד ציפורים בשנה. זהו המקור החשוב ביותר של חלבון מן החי בעולם (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). יתר על כן, אין טאבו תרבותי או דתי הקשור לגידול או לצריכה של תרנגולות. המיקרוביוטה של המעיים בעופות מעורבת באופן חשוב בגדילה של בעלי חיים, יחס המרת מזון, חסינות, עמידות בפני פתוגנים, בין תהליכים תזונתיים, פיזיולוגיים או פתולוגיים רבים אחרים4. הדור של תרנגולות ללא חיידקים הוא אפוא הכרחי כדי להדגיש את הדיאלוג בין המיקרוביוטה לבין המארחשלה 4. גם אם קהילות מיקרוביאליות מאכלסות את עוףoviduct 5, התוכן של ביצה שהוטלה זה עתה על ידי תרנגולת בריאה נקי ברובו ממיקרואורגניזמים, קליפת הביצה והממברנות בעלות מחסומים מכניים כדי למנוע פלישת מיקרואורגניזמים4. בנוסף, אפרוחים גדלים בקלות בהיעדר קרוביהם, אשר, בניגוד ליונקים, מאפשר ייצור של בעלי חיים ללא חיידקים ללא גידול הורי בתנאים סטריליים.
מתקן הניסוי “זיהום של חיות חווה, מודל וחיות בר” (PFIE, UE-1277, מרכז INRAE Val de Loire, Nouzilly, צרפת, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) הוא חלק מרשת התשתיות הלאומית הצרפתית EMERG’IN (https://www.emergin.fr/). PFIE שולטת בייצור תרנגולות ללא חיידקים כדי לבצע מחקרים ניסיוניים שונים במשך יותר מ -40 שנה 7,8,9,10,11. בעלי חיים אלה הופקו מביצים ספציפיות ללא פתוגנים (SPF) מקו הטלת קרן רגל לבן שגדל ברבייה סגורה מאז שנות ה-70 של המאה ה-20. ציפורים ללא חיידקים, המשמשות בעיקר למחקרים מיקרוביולוגיים 7,8,9, חוות התעוררות מחודשת של עניין עם שאלות כמו תרומת המיקרוביוטה של המעיים להתנהגות13, ניצול מזין14, התפתחות מערכת החיסון15 ופעילות אנדוקרינית. גם אם חלק מהמחקרים פורסמו באמצעות קווי ברוילר16 נטולי חיידקים, מחקרים אלה עדיין אינם מיוצגים כראוי בהשוואה למחקרים המשתמשים בקווי שכבות ניסיוניים. האבולוציה של השאלות המדעיות לקראת ההצלבה בין המיקרוביוטה לבין המארח שלה בבריאות ורווחת העופות הובילה אותנו להתאים את הפרוטוקול ההיסטורי שלנו כדי לייצר ברוילרים נטולי חיידקים של קו Ross PM3, קו העוף הברוילר הנפוץ ביותר בעולם.
מספר שיטות ליצירת תרנגולות ללא חיידקים תוארו בעבר 7,21,22. שיטות פשוטות, כמו זו המוצגת כאן, משתמשות בחומרי חיטוי שונים כדי להפחית את עומס החיידקים בפני השטח של הביצה ובמבודדים. חומרי החיטוי הנפוצים ביותר הם כספית כלוריד, אמוניום רבעוני, יודופורם, נתרן היפוכלוריט ותמיסות כלור דו חמצני. התוצאות הן לעתים קרובות משביעות רצון. עם זאת, למרות הנגישות של שיטות אלה, מעטים המבנים שיכולים ליישם את השיטה ולגדל את בעלי החיים בקנה מידה גדול, ובכך להפוך את השימוש בתרנגולות ללא חיידקים לגישה נדירה יחסית, המשמשת רק כדי לענות על שאלות מדעיות ספציפיות מאוד. השיטות, החומרים והציוד המתוארים כאן מאפשרים שיעור בקיעה יעיל ביותר של יצורים ללא נבטים, שנשארים בריאים וסטריליים למשך 3 שבועות לפחות (משך הניסויים המדעיים שאליהם הם יוצרו).
התוצאות מראות כי התאמת הפרוטוקול לייצור אפרוחים ללא חיידקים מביצים שנאספו בחוות עופות מסחריות היא מוצלחת. הניסיון בייצור ביצי SPF מגלה כי יעילות הבקיעה תלויה בעיקר בגיל התרנגולות המטילות ובאיכות הביצים שנאספו. שני הפרמטרים נלקחו בחשבון כאשר נבחרו חוות וביצים נאספו. באותה שיטה, שיעור הבקיעה הממוצע של תרנגולות ללא נבטים הוא הרבה יותר טוב מזה שהושג בייצור האחרון של תרנגולות מינון SPF במתקן שלנו (79% לעומת 35%), מבלי להשפיע על עקרות בעלי החיים (87% לעומת 83%). הבדלים אלה עשויים להיות קשורים לרקע הגנטי של הציפורים (broilers לעומת שכבות) כמו גם לאיכות קליפת הביצה, אשר סביר להניח להיות שברירית יותר בביצים של בעלי החיים SPF, המוחזקים ברבייה סגורה במשך יותר מ -40 שנה. יתר על כן, אנו גם מראים כי הובלה של יותר מ 2 שעות (מן החוות למתקן הניסוי) אינו משפיע על יעילות הבקיעה ואיכות.
אף על פי שתהליך העיקור המשמש לבקיעת מבודדים והפרוטוקול לפירוק ביצים עברו אופטימיזציה, כ-10% מהמבודדים לא היו נקיים מחיידקים. על מנת להבין את מקור הזיהום, חשוב מאוד לבצע בקרת סטריליות שגרתית של מבודדי הבקיעה לפני הכנסת הביצים.
בנוגע למצב הסטריליות של הציפורים, ניסינו ליישם שיטות המאפשרות צמיחה של חיידקים אנאירוביים אירוביים ולא עמידים מדגימות צואה, ובכך להבטיח שאנו מזהים חיידקים חיים בני קיימא. שיטות אלה תואמות את הפרמקופיות הבינלאומיות לבדיקות סטריליות ומייצגות טכניקות מהירות, קלות ומופחתות עלויות לשימוש שגרתי. עם זאת, ניתן ליישם טכניקות ביולוגיה מולקולרית כגון ריצוף גנים של 16S rRNA, אם כי לא נותנות מידע על כדאיות החיידקים, לאישור נוכחותם של חיידקים שאינם ניתנים לעיבוד. ואכן, מחקר שנערך לאחרונה העלה את ההשערה כי חלק מהחיידקים של המיקרוביוטה האימהית אובידוקט מועברים לעובר דרך חלבון הביצית, ובהמשך מהווים את רוב אוכלוסיית חיידקי המעיים העוברית5. יתר על כן, מחקר אחר העלה את ההשערה כי חלק מהמתיישבים המיקרוביאליים שהוכנסו לעוברים מוקדמים עברו בתורשה מתרנגולות אימהיות, והשפע והמגוון המיקרוביאליים של המעיים הושפעו מאוחר יותר מגורמים סביבתיים ומגנטיקה של המארחים במהלך התפתחות23. עם זאת, תוצאות המחקרים האלה מבוססות על ניתוח רצף דנ”א, שבו מספר גדול של חיידקים אלה יכולים להיות מתים או לא ניתנים לשכפול בחלבון הביצה (עמוס מאוד במולקולות אנטי-מיקרוביאליות). תומס ושותפיו16 ביצעו בדיקות סטריליות באמצעות הערכה של חיידקים אירוביים אירוביים וסיפקטיביים הניתנים לעיבוד באמצעות הטלת צואה על צלחות BHI, ובכך הדגישו את היעילות של שיטות בקטריולוגיות סטנדרטיות לבקרת סטריליות ללא חיידקים. יתר על כן, בפרוטוקול המוצע, השתמשנו בניטור גדילה בציר תיוגליקולאט עם רזאורין כדי להיות מסוגלים לזהות את הצמיחה של חיידקים אנאירוביים שאינם עמידים.
הפרוטוקול, שכבר שימש לייצור שליו ותרנגולות ללא נבטים, ניתן להתאמה לייצור בעלי חיים נטולי חיידקים מרוב הציפורים המקננות ומציע נקודות מבט לחקר תרומת המיקרוביוטה לפיזיולוגיה של בעלי חיים אלה. מלבד השימוש במודל זה כדי לחקור את האינטראקציות ההדדיות בין פונדקאי למיקרוביוטה במעי העופות, הוא עשוי להיות שימושי גם למחקר יישומי. לדוגמה, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את הבטיחות והיעילות של פרוביוטיקה שמקורה במיקרואורגניזמים של המעיים כדי לשפר את בריאותם ועמידותם של בעלי החיים.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים למגדלים ולחברה Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, צרפת) על אספקת ביציות מופרות. מחקר זה נערך בחסות קונסורציום המחקר APR-IA “INTEGRITY” (2017-2019), אשר מומן על ידי מרכז רג’יון ואל דה לואר, צרפת.
2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
50 mL tubes | Falcon | ||
BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
Pipette aid | Drummond | ||
Plastic pipettes | |||
Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |