Vurdering av de novo proteinsyntese priser i caenorhabditt elegans
Summary
Her introduserer og beskriver vi en ikke-radioaktiv og ikke-invasiv metode for å vurdere de novo proteinsyntese in vivo, ved hjelp av nematoden Caenorhabditis elegans og fluorescens utvinning etter fotobleaching (FRAP). Denne metoden kan kombineres med genetiske og/eller farmakologiske skjermer for å identifisere nye modulatorer av proteinsyntese.
Abstract
Opprettholde en sunn proteome er avgjørende for celle og organisme homeostase. Perturbasjon av balansen mellom proteinoversettelseskontroll og nedbrytning instigates en rekke aldersrelaterte sykdommer. Nedgang av proteostase kvalitetskontroll mekanismer er et kjennetegn på aldring. Biokjemiske metoder for å oppdage de novo proteinsyntese er fortsatt begrenset, har flere ulemper og kan ikke utføres i levende celler eller dyr. Caenorhabditis elegans, å være gjennomsiktig og lett genetisk modifisert, er en utmerket modell for å overvåke proteinsyntese priser ved hjelp av bildeteknikker. Her introduserer og beskriver vi en metode for å måle de novo proteinsyntese in vivo ved hjelp av fluorescensgjenvinning etter fotografering (FRAP). Transgene dyr som uttrykker fluorescerende proteiner i bestemte celler eller vev bestråles av en kraftig lyskilde som resulterer i fluorescens fotobleaching. I sin tur betyr vurdering av fluorescensutvinning ny proteinsyntese i celler og/eller vev av interesse. Derfor kan kombinasjonen av transgene nematoder, genetiske og/eller farmakologiske inngrep sammen med levende avbildning av proteinsynteserater kaste lys over mekanismer som medierer aldersavhengig proteostasekollaps.
Introduction
Proteinsyntese og nedbrytning er avgjørende for organismes homeostase. En rekke aldersrelaterte sykdommer er instigated av defekt proteinproduksjon1,2. For å måle globale proteinoversettelsesrater er det biokjemiske teknikker som ribosomal profilering, som innebærer dyp sekvensering av ribosombeskyttede mRNA-fragmenter for å overvåke uttrykk samt ny proteinsyntese3. Denne metoden, foruten å være en indirekte avlesning av translasjonelle priser, da økt RNA-tilknytning til ribosomer ikke nødvendigvis betyr økt oversettelse, har tekniske ulemper, for eksempel høye kostnader og et krav om en stor mengde startmateriale. På den annen side tillater proteomikkbaserte metoder direkte proteinkvantifisering ved puls metabolsk profilering etterfulgt av massespektrometrianalyse4,5. Dette er imidlertid en semi-kvantitativ tilnærming med begrenset temporal oppløsning som ikke lett kan brukes in vivo. Videre kan merking av proteinet være ulikt fordelt i dyr / vev av interesse. Viktigere, begge disse metodene kan skjule vevsspesifikke eller cellespesifikke variasjoner i proteinoversettelsesrater hos henholdsvis hele dyr eller vev.
Caenorhabditis elegans er en brukervennlig modell organisme som kan dyrkes i stort antall6. I tillegg, sin genetiske mottagelse og åpenhet tillate levende imaging in vivo. Denne protokollen beskriver metodikken for å oppdage proteinsyntesehastigheter ved hjelp av fluorescensgjenoppretting etter fotografering (FRAP). Vi drar nytte av det transgene uttrykket av fluorescerende proteiner, enten i hele organismen eller i spesifikke vev / celler. Transgene dyr kan enten uttrykke GFP ved hjelp av promoter av et gen, som er mye / globalt uttrykt eller en vevsspesifikk promotor for å målrette bestemte celletyper. Denne teknikken kan utvides til en bestemt promotor for å undersøke proteinsynteserater av et bestemt protein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteinsyntesemodulasjon er avgjørende for organismes homeostase. Under aldring er global så vel som spesifikk proteinsyntese perturbed. Nyere studier viser det faktum at protein oversettelse balanse direkte styrer senescence og aldring er ikke bare et biprodukt av aldringsprosessen. Spesielt kjernekomponenter i oversettelsesmaskineriet som eukaryotisk initieringsfaktor 4E (eIF4E), som letter mRNA-capping under oversettelsesinitiering, og dermed frekvensen av cap-avhengig proteinoversettelse, induserer oksidativt stres…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Chaniotakis M. og Kounakis K. for videoopptak og redigering. K.P. finansieres av et stipend fra Hellenic Foundation for Research and Innovation (HFRI) og Generalsekretariatet for forskning og teknologi (GSRT). N.T. er finansiert av tilskudd fra Det europeiske forskningsrådet (ERC – GA695190 – MANNA), Europakommisjonens rammeprogrammer og det greske kunnskapsdepartementet.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
Referências
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genética. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
