השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד
Summary
מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה ומודלים של עכברים מהונדסים גנטית הניתנים להשתלה מחדשים בנאמנות מחלות אנושיות והם מודלים מועדפים לחקר בסיסי ותרגום של סרטן השד. כאן, שיטה מתוארת להשתלה אורתוטופית שברי גידול השד לתוך כרית השומן הממארי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול ולהעריך את תגובת התרופה.
Abstract
מודלים פרה-קליניים המשיבים בנאמנות את ההטרוגניות של הגידול ואת התגובה הטיפולית הם קריטיים לחקר סרטן השד התרגומי. קווי תאים מונצחים קלים לגידול ושינוי גנטי כדי לחקור מנגנונים מולקולריים, אך הלחץ הסלקטיבי מתרבית התאים מוביל לעתים קרובות לשינויים גנטיים ואפיגנטיים לאורך זמן. מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה מסכמים בנאמנות את ההטרוגניות ואת התגובה ההתרופהית של גידולי השד האנושיים. דגמי PDX מציגים השהיה קצרה יחסית לאחר השתלה אורתוטופית המאפשרת את החקירה של ביולוגיה של גידול השד ותגובת התרופה. מודלי העכברים המונדסים גנטית הניתנים להשתלה מאפשרים לחקור חסינות לגידול בשד. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטה להשתלה אורתוטופית של שברי גידול בשד לתוך כרית השומן הממירי ואחריו טיפולים תרופתיים. מודלים פרה-אקליניים אלה מספקים גישות חשובות לחקור ביולוגיה של גידול השד, תגובת התרופה, גילוי סמנים ביולוגיים ומנגנונים של עמידות לתרופות.
Introduction
ניתן לייחס את רוב מקרי המוות מסרטן השד למחלות חוזרות ונשנות העמידות בפני טיפולים קונבנציונליים1,2. ההטרוגניות הבין-גידולית של סרטן השד תורמת להתנגדות לטיפול. יתר על כן, הטרוגניות הגידול יכול לפגוע באבחנה מדויקת ולאתגר ניהול מחלות3,4. זיהוי סמנים ביולוגיים חזויים של תגובה ישפר באופן משמעותי את התוצאות הקליניות של חולים עם סרטן השד. למרות שרוב סוגי סרטן השד הם גידולים ‘קרים’ מבחינה חיסונית שסביר להניח שאינם מגיבים לאימונותרפיה, מעכבי מחסום חיסוני הראו הבטחה בניסויים קליניים2,5. לדוגמה, ניסוי שלב III הראה הישרדות משופרת ללא מחלות (DFS) וראיות ראשוניות כי atezolizumab (נוגדן חד שבטי נגד PD-L1) בשילוב עם nab-paclitaxel עשוי לספק יתרון הישרדותי כולל לעומת nab-paclitaxel לבד בגידולים עם ≥1% PD-L1 מכתים6. פיתוח טיפולים החושניים גידולי שד לאימונותרפיה יחולל מהפכה במשטרי הטיפול.
מודלים פרה-קליניים המשיבים בנאמנות הטרוגניות של סרטן השד האנושי ותגובה תרופתית הם קריטיים לחקר ביולוגיה של הגידול ולזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לטיפול ממוקד. קווי תאים מונצחים נמצאים בשימוש נרחב לחקר סרטן השד מכיוון שקווי תאים אלה קלים לגידול ושינוי גנטי כדי לחקור מנגנונים מולקולריים. עם זאת, בשל הלחץ הסלקטיבי מתרבית התאים לטווח ארוך במבחנה, סחיפה גנטית עלולה להתרחש לאורך זמן וקווי תאים של סרטן השד עשויים לשאת שינויים גנומיים ספציפיים לקו התאים הנבדלים מסטיות בגידולי השד העיקריים7,8,9.
גושי גידול קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה מסוגלים לשחזר את ההטרוגניות של המחלה האנושית, והם דומים מבחינה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימית לגידול ממוצא10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. חשוב לציין, מודלים PDX יציבים פנוטיפי על פני השתלות מרובות כפי שמעידים היסתולוגיה, תמלולום, פרוטאום וניתוח גנומי10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. דגמי PDX מראים תגובות טיפול דומות לאלה שנצפו קלינית10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. דגמי PDX עבור קולטן אסטרוגן חיובי (ER+), קולטן פרוגסטרון חיובי (PR+), גורם גדילה אפידרמלי 2 חיובי (ERBB2+, HER2+) ומשולש שלילי סרטן השד (TNBC) דגמי PDX הוקמו, ומספקים פלטפורמה מצוינת לבדיקת טיפולים אנדוקריניים, כימותרפיים וממוקדים. עם זאת, אזהרה עיקרית אחת של דגמי PDX כיום היא היעדר מערכת חיסונית פונקציונלית בעכבר.
מודלי העכבר מהונדסים גנטית (GEMM), כגון Trp53 homozygous null, cMyc, Wnt1, PyMT או מודלים של ביטוי יתר של Her2, מאפשרים לחקור ייזום גידול ספונטני, התקדמות וחלומות בהקשר של מערכת חיסונית שלמה. עם זאת, השהיית הגידול ארוכה, מה שמקשה על ביצוע ניסויים פרה-קליניים עם זרועות מרובות30,31. עם זאת, GEMM ניתן להשתיל מארחים סינגניים כדי ליצור מספר מספיק של גידולים כי מקרוב recapitulate גידולים אנושיים32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. לדוגמה, אפיתל הממכר מעכבר BALB/c p53-null הושתל ברפידות השומן המנוקות של עכברי נמען מסוג בר סינגנים כדי ליצור גידולים ראשוניים, אשר ניתן להשתיל עוד יותר לתוך פונדקאים סינגנים56,57. הגידולים p53-null recapitulated תת סוגים שונים של גידולים אנושיים.
השילוב של דגמי PDX ו- GEMM הניתנת להשתלה מספק כלים פרה-אקליניים יקרי ערך לחקור ביולוגיה של גידול בשד, תגובת תרופות וחסינות נגד גידולים. בפרוטוקול הנוכחי, מתוארת שיטה להשתלה אורתוטופית של שברי גידול PDX ו- GEMM לתוך כרית השומן של העכבר. מודלים אלה מקובלים על מעברים סדרתיים ובדרך כלל לשמור על פנוטיפ יציב. כדי למתן את הסיכון של הסחף הגנטי או אובדן הטרוגניות על פני מעברים לאורך זמן, שברי רקמות מרובים הם cryop שמורים בכל מעבר להשתלה הבאה במקרה ששינויים ביולוגיים או מורפולוגיים נצפים לאורך זמן29,58.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להפחית את הווריאציות בגידול על פני בעלי חיים, זה קריטי לחתוך את רקמת הגידול לתוך 1 מ”מ3 שברים להשתלה. מודלים המגדלים רקמות רכות קשה יותר לעבודה עם שברי הגידול צריך להיות לחתוך קצת יותר גדול (1−2 מ”מ3). בעת הצבת הרקמה בכיס כרית השומן הממארי יש להקפיד לא לפצל את הרקמה לחתיכות מרוב?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R37CA2228304 ו R01HL146642 לשי חן, CA148761 לג’פרי מ. רוזן), משרד ההגנה האמריקאי (W81XWH-19-1-0524 לשי צ’ן, W81XWH-19-1-0035 ל-Xiangdong Lv), האגודה האמריקנית לסרטן (RSG-18-181-01-TBE לשי צ’ן) והמכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (RR150009 CPRIT Scholar In Cancer Research Award ל-Xi Chen), ליבת דגמי Vivo המתקדמים של קסנוגרפט (קסנוגרפט ודגמי Vivo המתקדמים המתקדמים ביילור קולג’ לרפואה) (מימון מענק מתקן הליבה של RP170691 ומענק תמיכה במרכז הסרטן NCI-CA125123 P30).
Materials
| 1 mg/mL Buprenorphine-SR | ZooPharm (via BCM veterinarians) | Sterile | |
| 26G syringe | BD | 148232E | Sterile |
| Betadine Scrub | Fisher | 19-027132 | |
| Cotton Swabs | VWR International Laboratory | 89031-272 | Sterile |
| DMEM | Fisher | MT 10-013-CM | Sterile |
| Electric shaver | Oster | 78005-050 | |
| Glass beads sterilizer (Germinator) | Roboz Surgical Store | DS-401 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-062-35 | |
| Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5139 | Sterile |
| Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter) | Roboz Surgical Store | RS-5658BT | Sterile |
| Micro Forceps (tissue placing forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5069 | Sterile |
| Petri Dish | Fisher | 08-757- 100D | Sterile |
| Sterile drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | Sterile |
| Surgery scissors | Roboz Surgical Store | RS-5960 | Sterile |
| Tissue Forceps (claw forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5158 | Sterile |
| Wound clip applier | BD Autoclip Wound System | 01-804 | Sterile |
| Wound clip remover | BD Autoclip Wound System | 01-804-15 | Sterile |
| Wound clips | BD Autoclip Wound System | 01-804-5 | Sterile |
Referências
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast Cancer Treatment: A Review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Harbeck, N., et al. Breast cancer. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 66 (2019).
- Harbeck, N., Salem, M., Nitz, U., Gluz, O., Liedtke, C. Personalized treatment of early-stage breast cancer: present concepts and future directions. Cancer Treatment Reviews. 36 (8), 584-594 (2010).
- Zardavas, D., Irrthum, A., Swanton, C., Piccart, M. Clinical management of breast cancer heterogeneity. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (7), 381 (2015).
- Esteva, F. J., Hubbard-Lucey, V. M., Tang, J., Pusztai, L. Immunotherapy and targeted therapy combinations in metastatic breast cancer. The Lancet Oncology. 20 (3), e175-e186 (2019).
- Schmid, P., et al. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. New England Journal of Medicine. 379 (22), 2108-2121 (2018).
- Tsuji, K., et al. Breast cancer cell lines carry cell line-specific genomic alterations that are distinct from aberrations in breast cancer tissues: comparison of the CGH profiles between cancer cell lines and primary cancer tissues. BMC Cancer. 10 (1), 15 (2010).
- Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
- Clarke, R. Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer-the immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines. Breast Cancer Research and Treatment. 39 (1), 69-86 (1996).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514 (2011).
- Kuperwasser, C., et al. Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America of the United States of America. 101 (14), 4966-4971 (2004).
- Vaillant, F., et al. Targeting BCL-2 with the BH3 mimetic ABT-199 in estrogen receptor-positive breast cancer. Cancer Cell. 24 (1), 120-129 (2013).
- Li, S., et al. Endocrine-therapy-resistant ESR1 variants revealed by genomic characterization of breast-cancer-derived xenografts. Cell Reports. 4 (6), 1116-1130 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Current Protocols in Pharmacology. 60 (1), 14.23.11-14.23.43 (2013).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Research. 16 (2), R36 (2014).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118 (2007).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: Influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. International Journal of Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
- Sebesteny, A., et al. Primary human breast carcinomas transplantable in the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 63 (6), 1331-1337 (1979).
- Sakakibara, T., et al. Growth and metastasis of surgical specimens of human breast carcinomas in SCID mice. The Cancer Journal from Scientific American. 2 (5), 291-300 (1996).
- Rae-Venter, B., Reid, L. M. Growth of human breast carcinomas in nude mice and subsequent establishment in tissue culture. Pesquisa do Câncer. 40 (1), 95-100 (1980).
- Outzen, H., Custer, R. Brief communication: Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Noël, A., et al. Heterotransplantation of primary and established human tumour cells in nude mice. Anticancer Research. 15 (1), 1-7 (1995).
- Naundorf, H., Fichtner, I., Büttner, B., Frege, J. Establishment and characterization of a new human oestradiol-and progesterone-receptor-positive mammary carcinoma serially transplantable in nude mice. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 119 (1), 35-40 (1992).
- Murthy, M. S., Scanlon, E. F., Jelachich, M. L., Klipstein, S., Goldschmidt, R. A. Growth and metastasis of human breast cancers in athymic nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 13 (1), 3-15 (1995).
- Fichtner, I., Becker, M., Zeisig, R., Sommer, A. In vivo models for endocrine-dependent breast carcinomas: special considerations of clinical relevance. European Journal of Cancer. 40 (6), 845-851 (2004).
- Ding, L., et al. Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft. Nature. 464 (7291), 999 (2010).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Pesquisa do Câncer. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Borowsky, A. D. Choosing a mouse model: experimental biology in context-the utility and limitations of mouse models of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a009670 (2011).
- Caligiuri, I., Rizzolio, F., Boffo, S., Giordano, A., Toffoli, G. Critical choices for modeling breast cancer in transgenic mouse models. Journal of Cellular Physiology. 227 (8), 2988-2991 (2012).
- Backlund, M. G., et al. Impact of ionizing radiation and genetic background on mammary tumorigenesis in p53-deficient mice. Pesquisa do Câncer. 61 (17), 6577-6582 (2001).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052-1058 (2000).
- Hüsler, M. R., et al. Lactation-induced WAP-SV40 Tag transgene expression in C57BL/6J mice leads to mammary carcinoma. Transgenic Research. 7 (4), 253-263 (1998).
- Simin, K., et al. pRb inactivation in mammary cells reveals common mechanisms for tumor initiation and progression in divergent epithelia. PLoS Biology. 2 (2), e22 (2004).
- Sandgren, E. P., et al. Inhibition of mammary gland involution is associated with transforming growth factor α but not c-myc-induced tumorigenesis in transgenic mice. Pesquisa do Câncer. 55 (17), 3915-3927 (1995).
- Gallahan, D., et al. Expression of a truncated Int3 gene in developing secretory mammary epithelium specifically retards lobular differentiation resulting in tumorigenesis. Pesquisa do Câncer. 56 (8), 1775-1785 (1996).
- Tsukamoto, A. S., Grosschedl, R., Guzman, R. C., Parslow, T., Varmus, H. E. Expression of the int-1 gene in transgenic mice is associated with mammary gland hyperplasia and adenocarcinomas in male and female mice. Cell. 55 (4), 619-625 (1988).
- Guy, C. T., Cardiff, R., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Guy, C. T., et al. Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (22), 10578-10582 (1992).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37 (1999).
- Maroulakou, I. G., Anver, M., Garrett, L., Green, J. E. Prostate and mammary adenocarcinoma in transgenic mice carrying a rat C3 (1) simian virus 40 large tumor antigen fusion gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (23), 11236-11240 (1994).
- Yin, Y., et al. Characterization of medroxyprogesterone and DMBA-induced multilineage mammary tumors by gene expression profiling. Molecular Carcinogenesis. 44 (1), 42-50 (2005).
- Cressman, V. L., et al. Mammary tumor formation in p53-and BRCA1-deficient mice. Cell Growth and Differentiation-Publication American Association for Cancer Research. 10 (1), 1-10 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Pond, A. C., et al. Fibroblast growth factor receptor signaling dramatically accelerates tumorigenesis and enhances oncoprotein translation in the mouse mammary tumor virus-Wnt-1 mouse model of breast cancer. Pesquisa do Câncer. 70 (12), 4868-4879 (2010).
- Sinn, E., et al. Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc genes in transgenic mice: synergistic action of oncogenes in vivo. Cell. 49 (4), 465-475 (1987).
- Muller, W. J., et al. The int-2 gene product acts as an epithelial growth factor in transgenic mice. The EMBO Journal. 9 (3), 907-913 (1990).
- Liu, S., et al. Expression of autotaxin and lysophosphatidic acid receptors increases mammary tumorigenesis, invasion, and metastases. Cancer Cell. 15 (6), 539-550 (2009).
- Torres-Arzayus, M. I., et al. High tumor incidence and activation of the PI3K/AKT pathway in transgenic mice define AIB1 as an oncogene. Cancer Cell. 6 (3), 263-274 (2004).
- Chan, S. R., et al. STAT1-deficient mice spontaneously develop estrogen receptor α-positive luminal mammary carcinomas. Breast Cancer Research. 14 (1), R16 (2012).
- Jiang, Z., et al. Rb deletion in mouse mammary progenitors induces luminal-B or basal-like/EMT tumor subtypes depending on p53 status. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3296-3309 (2010).
- Adams, J. R., et al. Cooperation between Pik3ca and p53 mutations in mouse mammary tumor formation. Pesquisa do Câncer. 71 (7), 2706-2717 (2011).
- Pei, X. H., et al. CDK inhibitor p18INK4c is a downstream target of GATA3 and restrains mammary luminal progenitor cell proliferation and tumorigenesis. Cancer Cell. 15 (5), 389-401 (2009).
- Bultman, S., et al. Characterization of mammary tumors from Brg1 heterozygous mice. Oncogene. 27 (4), 460 (2008).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052 (2000).
- Zhang, M., et al. Identification of tumor-initiating cells in a p53-null mouse model of breast cancer. Pesquisa do Câncer. 68 (12), 4674-4682 (2008).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Research. 15 (1), 201 (2013).
- Zhang, X., Lewis, M. T. Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models of Human Breast Cancer. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (1), 21-29 (2013).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of Visualized Experiments. (8), e308 (2007).
- Zhao, N., et al. Pharmacological targeting of MYC-regulated IRE1/XBP1 pathway suppresses MYC-driven breast cancer. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1283-1299 (2018).
- DeOme, K., Faulkin, L., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Pesquisa do Câncer. 19 (5), 515 (1959).
