Trapianto ortotopico di tumori al seno come modelli preclinici per il cancro al seno
Summary
I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e i modelli murini trapiantabili geneticamente modificati ricapitolano fedelmente la malattia umana e sono modelli preferiti per la ricerca di base e traslazionale sul cancro al seno. Qui, viene descritto un metodo per trapiantare ortotopicamente frammenti di tumore al seno nel cuscinetto di grasso mammario per studiare la biologia del tumore e valutare la risposta al farmaco.
Abstract
I modelli preclinici che ricapitolano fedelmente l’eterogeneità del tumore e la risposta terapeutica sono fondamentali per la ricerca traslazionale sul cancro al seno. Le linee cellulari immortalizzate sono facili da coltivare e modificare geneticamente per studiare i meccanismi molecolari, ma la pressione selettiva della coltura cellulare spesso porta ad alterazioni genetiche ed epigenetiche nel tempo. I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) ricapitolano fedelmente l’eterogeneità e la risposta al farmaco dei tumori al seno umani. I modelli PDX mostrano una latenza relativamente breve dopo il trapianto ortotopico che facilita lo studio della biologia del tumore al seno e della risposta ai farmaci. I modelli murini geneticamente modificati trapiantabili consentono lo studio dell’immunità del tumore al seno. L’attuale protocollo descrive il metodo per trapiantare ortotopicamente frammenti di tumore al seno nel cuscinetto di grasso mammario seguito da trattamenti farmacologici. Questi modelli preclinici forniscono approcci preziosi per studiare la biologia del tumore al seno, la risposta ai farmaci, la scoperta di biomarcatori e i meccanismi di resistenza ai farmaci.
Introduction
La maggior parte dei decessi per cancro al seno può essere attribuita a malattie ricorrenti resistenti alle terapie convenzionali1,2. L’eterogeneità inter- e intra-tumorale dei tumori al seno contribuisce alla resistenza alla terapia. Inoltre, l’eterogeneità del tumore può compromettere una prognosi accurata e sfidare la gestione della malattia3,4. L’identificazione di biomarcatori predittivi di risposta migliorerà significativamente gli esiti clinici delle pazienti con cancro al seno. Anche se la maggior parte dei tipi di cancro al seno sono tumori immunologicamente “freddi” che probabilmente non rispondono all’immunoterapia, gli inibitori del checkpoint immunitario hanno mostrato risultati promettenti negli studi clinici2,5. Ad esempio, uno studio di fase III ha mostrato un miglioramento della sopravvivenza libera da malattia (DFS) e prove preliminari che atezolizumab (anticorpo monoclonale contro PD-L1) combinato con nab-paclitaxel può fornire un beneficio di sopravvivenza globale rispetto a nab-paclitaxel da solo nei tumori con colorazione PD-L1 ≥1%6. Lo sviluppo di terapie che sensibilizzano i tumori al seno all’immunoterapia rivoluzionerà i regimi di trattamento.
I modelli preclinici che ricapitolano fedelmente l’eterogeneità del cancro al seno umano e la risposta ai farmaci sono fondamentali per studiare la biologia del tumore e identificare potenziali biomarcatori per la terapia mirata. Le linee cellulari immortalizzate sono ampiamente utilizzate per la ricerca sul cancro al seno poiché queste linee cellulari sono facili da coltivare e modificano geneticamente per studiare i meccanismi molecolari. Tuttavia, a causa della pressione selettiva della coltura cellulare a lungo termine in vitro, la deriva genetica può verificarsi nel tempo e le linee cellulari del cancro al seno possono portare alterazioni genomiche specifiche della linea cellulare che sono distinte dalle aberrazioni nei tumori mammari primari7,8,9.
I blocchi tumorali derivati dallo xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) sono in grado di ricapitolare l’eterogeneità della malattia umana e sono istologicamente e immunoistochimicamente simili al tumore di origine10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. È importante sottolineare che i modelli PDX sono fenotipicamente stabili in più trapianti, come evidenziato dall’istologia, dal trascrittoma, dal proteoma e dall’analisi genomica10,11, 12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. I modelli PDX mostrano risposte al trattamento paragonabili a quelle osservate clinicamente10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. Sono stati stabiliti modelli PDXper il recettore degli estrogeni positivo (ER +), il recettore del progesterone positivo (PR+),il fattore di crescita epidermico2positivo (ERBB2 +, HER2+)e il carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) I modelli PDX e forniscono un’eccellente piattaforma per testare terapie endocrine, chemio e mirate. Tuttavia, un avvertimento principale dei modelli PDX al momento è la mancanza di un sistema immunitario funzionale nel topo.
I modelli murini geneticamente modificati (GEMM), come i modelli di sovraespressione Omozigoti Trp53 null, cMyc, Wnt1, PyMT o Her2, consentono lo studio dell’inizio spontaneo del tumore, della progressione e delle metastasi nel contesto di un sistema immunitario intatto. Tuttavia, la latenza tumorale è lunga, il che rende difficile condurre studi preclinici con più bracci30,31. Tuttavia, GEMM può essere trapiantato in ospiti singenici per generare un numero sufficiente di tumori che ricapitolano strettamente i tumori umani32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Ad esempio, l’epitelio mammario di un topo BALB/c p53-null è stato trapiantato nei cuscinetti adiposi eliminati di topi riceventi wild-type singenici per formare tumori primari, che possono essere ulteriormente trapiantati in ospiti singenici56,57. I tumori p53-null ricapitolati diversi sottotipi di tumori umani.
La combinazione di modelli PDX e GEMM trapiantabile fornisce preziosi strumenti preclinici per studiare la biologia del tumore al seno, la risposta ai farmaci e l’immunità antitumorale. Nel protocollo attuale, viene descritto un metodo di trapianto ortotopico di frammenti tumorali PDX e GEMM nel cuscinetto di grasso mammario del topo. Questi modelli sono suscettibili di passaggi seriali e di solito mantengono un fenotipo stabile. Per mitigare il rischio di deriva genetica o perdita di eterogeneità tra i passaggi nel tempo, più frammenti di tessuto vengono crioconservati ad ogni passaggio per il successivo trapianto nel caso in cui si osservino cambiamenti biologici o morfologici nel tempo29,58.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per ridurre le variazioni nella crescita del tumore tra gli animali, è fondamentale tagliare il tessuto tumorale in 1 mm3 frammenti per il trapianto. I modelli che crescono i tessuti molli sono più difficili da lavorare e i frammenti tumorali devono essere tagliati leggermente più grandi (1-2 mm3). Quando si posiziona il tessuto nella tasca del cuscinetto di grasso mammario, fare attenzione a non dividere il tessuto in più pezzi in quanto ciò si tradurrà in più piccoli tumori o tumori di form…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R37CA228304 e R01HL146642 a Xi Chen, CA148761 a Jeffrey M. Rosen), dal Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (W81XWH-19-1-0524 a Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 a Xiangdong Lv), dall’American Cancer Society (RSG-18-181-01-TBE a Xi Chen) e dal Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award a Xi Chen), il Patient-Derived Xenograft e Advanced In Vivo Models Core presso il Baylor College of Medicine (finanziamento da RP170691 CPRIT Core Facility Award e NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant).
Materials
| 1 mg/mL Buprenorphine-SR | ZooPharm (via BCM veterinarians) | Sterile | |
| 26G syringe | BD | 148232E | Sterile |
| Betadine Scrub | Fisher | 19-027132 | |
| Cotton Swabs | VWR International Laboratory | 89031-272 | Sterile |
| DMEM | Fisher | MT 10-013-CM | Sterile |
| Electric shaver | Oster | 78005-050 | |
| Glass beads sterilizer (Germinator) | Roboz Surgical Store | DS-401 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-062-35 | |
| Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5139 | Sterile |
| Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter) | Roboz Surgical Store | RS-5658BT | Sterile |
| Micro Forceps (tissue placing forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5069 | Sterile |
| Petri Dish | Fisher | 08-757- 100D | Sterile |
| Sterile drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | Sterile |
| Surgery scissors | Roboz Surgical Store | RS-5960 | Sterile |
| Tissue Forceps (claw forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5158 | Sterile |
| Wound clip applier | BD Autoclip Wound System | 01-804 | Sterile |
| Wound clip remover | BD Autoclip Wound System | 01-804-15 | Sterile |
| Wound clips | BD Autoclip Wound System | 01-804-5 | Sterile |
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