عزل وثقافة الخلايا العصبية الأولية وغليا من المثانة البولية الجرذ الكبار
Summary
يحاول هذا البروتوكول إنشاء بروتوكول قابل للتكرار للخلايا العصبية الأولية وعزل غليا عن مثانة الفئران لإجراء المزيد من التجارب الخلوية.
Abstract
المسالك البولية السفلية لها وظيفتين رئيسيتين، وهما تخزين البول الدوري وmicturition. يتم التوسط في هذه الوظائف من خلال التنظيم العصبي المركزي والمحيطي. على الرغم من إجراء بحوث مستفيضة على الجهاز العصبي المسالك البولية السفلي, وقد ركزت معظم الدراسات على الثقافة الأولية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لعزل وثقافة الخلايا العصبية المثانة وغليا من الفئران سبراغ داولي. في هذه الطريقة، تم احتضان الخلايا العصبية وغليا في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 5-7 أيام. ونتيجة لذلك ، نمت إلى أشكال ناضجة مناسبة للتجارب المناعية اللاحقة ذات الصلة. لوحظت الخلايا بشكل مورفولوجي باستخدام المجهر البصري. تم التعرف على الخلايا العصبية، الحويصلات متشابك، وغليا من قبل β-III-tubulin و MAP-2، سينابسين-1، و تلطيخ GFAP، على التوالي. وفي الوقت نفسه، تم إجراء الكيمياء المناعية على العديد من البروتينات ذات الصلة بالناقل العصبي، مثل أسيتيل ترانسفيراز الكولين، DYNLL2، وSLC17A9.
Introduction
المسالك البولية السفلية لها وظيفتين رئيسيتين: تخزين البول الدوري وmicturition1. يتحكم الجهاز العصبي السفلي للمسالك البولية (LUTNS) في هذه الوظائف وهو حساس وعرضة للعديد من الاعتلالات العصبية ، والتي يمكن أن تكون فطرية (البورفيريا) ، المكتسبة (مرض لايم) ، والثانوية لحالات المرض (اعتلال المثانة السكري) ، أو المخدرات الناجمة (التهاب المثانة النزفي) ، أو الجراحة الناجمة (استئصال البطن) ، أو الإصابة الناجمة(إصابةالحبل الشوكي الرضية) 2،3،4،5،6،7. في الدراسات الفسيولوجية / المرضية ، في الجسم الحي وفي المختبر التجارب لا تقل أهمية. بينما في الجسم الحي وقد أجريت البحوث على LUTNS في الجهاز, الخلوية, والمستويات الجزيئية لبعض الوقت, في المختبر البحوث على الخلايا العصبية الأولية من المثانة البولية غير موجود تقريبا8,9. وعلى الرغم من أن هذه الدراسة محدودة، إلا أننا نأمل في ريادة الأبحاث في هذا المجال حتى يتمكن باحثون آخرون من تحسينها. وبهذه الطريقة، قد تؤدي هذه الثقافة المشتركة إلى فهم خلوي للخلل الفسيولوجي في الأنماط الظاهرية، مثل خلل الخلايا العصبية في المثانة.
على النقيض من العضلات المعوية مع اتجاه واضح للخلايا العضلية في طبقات منفصلة ، فإن عضلات المثانة غيرمنظمة 10. لذلك ، بدلا من تقشير الطبقة الخارجية من المثانة ، تقترح هذه الطريقة هضم المثانة بأكملها لتقليل صعوبة التشغيل وتقصير وقت المعالجة المسبقة لمعدل بقاء الخلايا المرتفع.
بعد هذه الطريقة، يمكننا الحصول على ثقافة مختلطة من الخلايا العصبية وغيرها من الخلايا. الخلايا الأخرى لا غنى عنها لأن وجودها يحاكي بيئة في الجسم الحي11. وبالإضافة إلى ذلك، توفر هذه الخلايا المواد غير متوفرة في الوسط.
تتضمن هذه الطريقة خطوتين للهضم. أولا، يستخدم الكولاجين من النوع الثاني لتحلل الكولاجين، يليه تريبسين، لتفكيك الأنسجة إلى خلايا10. وبهذه الطريقة، يتم توزيع أنسجة المثانة في خلايا واحدة ومن ثم تنمو مستقلة نسبيا. عندما تنضج ثقافة الخلايا العصبية، يمكن استخدام الخلايا العصبية للتصوير أو المقايسات الوظيفية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعداد اللوحة
استخدام الأغطية الزجاجية في 6-، 12-، أو 48 جيدا لوحات الثقافة لتجارب التصوير المناعي أو الكالسيوم هو عملية اقتصادية وتجنيب العينة. تنمو الخلايا بشكل جيد في لوحات دون coverlips أثناء إعداد ثقافات الخلايا الأولية. لذلك ، يمكن الاستغناء عن الأغطية في التجارب ، مثل تفاعل سلسل?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81673676) ومكتب دونغقوان للعلوم والتكنولوجيا (المنحة رقم 2019622101002). يشكر المؤلفون الدكتورة ماريروز سوليفان (أستاذة مساعدة في الجراحة، كلية الطب بجامعة هارفارد) على الاستشارات التقنية.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
Referências
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Golbidi, S., Laher, I. Bladder dysfunction in diabetes mellitus. Frontiers in Pharmacology. 1, 136 (2010).
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants – A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
