Isolation und Kultur der primär neuronen und Glia von Adult Ratte Harnblase
Summary
Dieses Protokoll versucht, ein wiederholbares Protokoll für primäre Neuronen und Gliaisolation von Rattenblase für weitere zelluläre Experimente zu etablieren.
Abstract
Die unteren Harnwege hat zwei Hauptfunktionen, nämlich regelmäßige Urinlagerung und Micturition; diese Funktionen werden durch zentrale und periphere Neuroregulation vermittelt. Obwohl umfangreiche Forschung über die unteren Harnwege Nervensystem durchgeführt wurde, die meisten Studien haben sich auf primärkultur konzentriert. Dieses Protokoll führt eine Methode zur Isolierung und Kultur von Blasenneuronen und Glia von Sprague-Dawley Ratten ein. Bei dieser Methode wurden die Neuronen und Glia in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 5–7 Tage inkubiert. Infolgedessen wuchsen sie zu ausgereiften Formen heran, die für verwandte nachfolgende Immunfluoreszenzexperimente geeignet waren. Die Zellen wurden mit einem optischen Mikroskop morphologisch beobachtet. Neuronen, synaptische Vesikel und Glia wurden durch β-III-Tubulin und MAP-2, Synapsin-1 bzw. GFAP-Färbung identifiziert. In der Zwischenzeit wurde die Immunzytochemie an mehreren Neurotransmitter-bezogenen Proteinen durchgeführt, wie Cholin-Acetyltransferase, DYNLL2 und SLC17A9.
Introduction
Der untere Harnweg hat zwei Hauptfunktionen: periodische Urinlagerung und Micturition1. Die unteren Harnwege Nervensystem (LUTNS) steuert diese Funktionen und ist empfindlich und anfällig für viele Neuropathien, die angeboren sein können (Porphyrie), erworben (Lyme-Krankheit), sekundär zu Krankheitszuständen (diabetische Zystopathie), medikamentös induziert (hämorrhagische Zystitis), Chirurgie verursacht (abdominoperinealresektion), oder Verletzungen verursacht (traumatische Rückenmarksverletzung)2,3,4,5,6. In physiologisch-pathologischen Studien sind In-vivo- und In-vitro-Experimente gleichermaßen wichtig. Während in vivo Forschung auf LUTNS wurde auf Organ-, zelluläre, und molekulare Ebene für einige Zeit durchgeführt, In-vitro-Forschung an primären Neuronen aus der Harnblase ist fast nicht existent8,9. Obwohl die vorliegende Studie begrenzt ist, hoffen wir, die Forschung in diesem Bereich voranzutragen, damit andere Forscher sie verbessern können. Auf diese Weise, Diese Co-Kultur kann zu einem zellulären Verständnis der physiologischen Dysfunktion in Phänotypen führen, wie Blase Neuron Dysfunktion.
Im Gegensatz zu enterischen Muskeln mit einer klaren Richtung der Muskelzellen in diskrete Schichten sind die Muskeln der Blase unorganisiert10. Anstatt die äußere Schicht der Blase abzuschälen, schlägt diese Methode daher vor, die gesamte Blase zu verdauen, um die Schwierigkeit des Betriebs zu reduzieren und die Vorverarbeitungszeit für eine hohe Zellüberlebensrate zu verkürzen.
Nach dieser Methode können wir eine gemischte Kultur von Neuronen und anderen Zellen erhalten. Die anderen Zellen sind unentbehrlich, da ihre Anwesenheit eine in vivo Umgebung imitiert11. Darüber hinaus liefern solche Zellen die Substanzen, die im Medium nicht verfügbar sind.
Diese Methode umfasst zwei Schritte für die Verdauung. Zunächst wird Kollagenase Typ II verwendet, um Kollagen zu hydrolysieren, gefolgt von Trypsin, um das Gewebe in Zellen10zu dissoziieren. Auf diese Weise werden Blasengewebe in einzelne Zellen dispergiert und wachsen dann relativ unabhängig. Wenn die Kultur der Neuronen reift, können die Neuronen für bildgebende oder funktionelle Assays verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plattenvorbereitung
Die Verwendung von Glasabdeckungen in 6-, 12- oder 48-Well-Kulturplatten für immunfluoreszierende oder Kalzium-Bildgebungsexperimente ist eine wirtschaftliche und probenschonende Operation. Zellen wachsen gut in Platten ohne Decklippen während der Herstellung von primären Zellkulturen. Daher sind Coverlips in Experimenten wie Western Blot oder Polymerase-Kettenreaktion entbehrlich. Darüber hinaus ist die Beschichtung ein notwendiger Schritt vor der Beschichtung von Zellen, mit …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr. 81673676) und dem Dongguan Science and Technology Bureau (Grant-Nr. 2019622101002) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Maryrose Sullivan (Assistant Professor in Surgery, Harvard Medical School) für die technische Beratung.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
Referências
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