Um protocolo para bloquear o fluxo linfático por sutura cirúrgica de vasos linfáticos diferentes é apresentado.
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Artigo de método
Bloqueando o fluxo linfático suturing afferent vasos linfáticos em camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os vasos linfáticos são fundamentais na manutenção do equilíbrio dos fluidos teciduais e na otimização da proteção imunológica, transportando antígenos, citocinas e células para drenar linfonodos (LNs). A interrupção do fluxo linfático é um método importante ao estudar a função dos vasos linfáticos. Os diferentes vasos linfáticos do footpad murine aos linfonodos popliteis (pLNs) são bem definidos como as únicas rotas para drenagem linfática para as pLNs. Suturar esses vasos linfáticos diferentes pode impedir seletivamente o fluxo linfático para as PLNs. Este método permite a interferência no fluxo linfático com danos mínimos às células linfáticas do endotelial linfático no pLN drenante, os vasos linfáticos aferentes, bem como outros vasos linfáticos ao redor da área. Este método tem sido usado para estudar como a linfática impacta as venules endoteliais altas (HEV) e a expressão da quimioterapia na LN, e como o linfático flui através do tecido adiposo ao redor da LN na ausência de vasos linfáticos funcionais. Com o reconhecimento crescente da importância da função linfática, este método terá aplicações mais amplas para desvendar ainda mais a função dos vasos linfáticos na regulação do microambiente LN e respostas imunológicas.
Introdução
A organização espacial do sistema linfático fornece suporte estrutural e funcional para remover eficientemente o fluido extracelular e transportar antígenos e células que apresentam antígenos (APCs) para as LNs drenantes. Os vasos linfáticos iniciais (também chamados de capilares linfáticos) são altamente permeáveis devido às suas junções intercelulares descontínuas, que facilitam a coleta efetiva de fluidos, células e outros materiais dos espaços extracelulares circundantes1. Os vasos linfáticos iniciais se fundem na coleta de vasos linfáticos, que possuem junções intercelulares apertadas, uma membrana contínua do porão e cobertura muscular li....
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Protocolo
Todo o trabalho animal precisa ser aprovado pela comissão de ética institucional e governamental e manejo de animais. Esta é uma cirurgia de não sobrevivência.
1. Preparação de materiais
- Prepare 100 mL de 70% de etanol misturando 70 mL de 100% de etanol com 30 mL de água estéril. Autoclave todas as ferramentas cirúrgicas antes da cirurgia e mantenha as ferramentas em 70% de etanol antes e durante a cirurgia para manter a esterilização.
- Prepare um aparelho de injeção.
- Corte ~30 cm de tubos de polietileno (0,28 mm de diâmetro). Conecte a ponta de uma agulha de 30 G x 1/2 (agulha A) a uma extremidade do tubo de pol....
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Resultados
A sutura do vaso linfático tem sido usada em estudos anteriores15,16,17,19, onde serviu como uma importante ferramenta para estudar a função do fluxo linfático antes que a biologia molecular dos vasos linfáticos fosse melhor compreendida. O bloqueio do fluxo linfático interrompe a homeostase LN, o que leva os HEVs a perder a expressão genética crítica necessária para o melhor linfócito para a L.......
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Discussão
O bloqueio do fluxo linfático terá amplas aplicações na manipulação do fornecimento de antígenos ao LN em condições saudáveis e doentes. É possível usar este método para controlar o tempo de entrega de antígenos, a fim de estudar como o fluxo linfático contínuo regula a resposta imune na drenagem de LNs. Este método de interrupção do fluxo linfático também pode ser usado para estudar como a linfática impacta a compartimentação celular, ativação celular, migração celular e interações célula-célula no LN.
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Ava Zardynezhad pela revisão do manuscrito. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR, PJT-156035), e pela Fundação Canadense de Inovação para AFIN (32930), e pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China para Yujia Lin (81901576).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,9% de solução salina de cloreto de sódio | Baxter | JB1323 | |
| 100% etanol | Greenfield Global | University of Calgary serviços de distribuição UN1170. | |
| Creme depilatório | Nair | Nair Sensitive Formula Creme para Depilação; me com Óleo de Amêndoa Doce e Óleo de Bebê, 200 ml. Ou produto similar. | |
| corante azul Evans | Sigma Life Science | E2129-10G | Para 1 ml de corante azul Evans, adicione 0,1 g de azul Evans a 10 ml de PBS. A solução Evens Blue será filtrada através de filtros de 0,22 mm e mantida estéril em alíquotas de 1ml. |
| Isômero I de isotiocianato de fluoresceína (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Fórceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Fórceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Aparelho de injeção | Conecte uma extremidade da tubulação de polietileno a 30G &vezes; ½ agulha. Coloque uma seringa de 1 ml de TB na agulha. Desalojar o eixo da agulha de mais 30G &vezes; ½ agulha. Insira a extremidade romba do 30G &vezes; ½ eixo da agulha na outra extremidade do tubo. O diâmetro interno desta tubulação é de 0,28 mm. Assim, 1,6 cm de fluido na tubulação é 1 μl. | ||
| Seringa de insulina | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep reta | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Cetamina | Narketan | DIN 02374994 | Os fornecedores de cetamina e xilazina geralmente estão sob regulamentação institucional e governamental. |
| Agulhas (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Agulhas (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Reto, Sem Trava; Serrilhado |
| Fosfato Tamponado Salino (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Tubo de polietileno | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Fita cirúrgica (1,25cmx9,1m) | Transpore | 1527-0 | |
| Fita cirúrgica (2,5cmx9,1m) | Transpore | 1527-1 | |
| Sutura | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0,7 monofilamento métrico polipropileno |
| Seringa (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | Os fornecedores de cetamina e xilazina geralmente estão sob regulamentação institucional e governamental. |
| Equipamento | |||
| Microscópio de dissecação | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) com fonte de luz: Olympus Highlight 3100 | |
| Microscópio confocal | Leica | SP8 |
Referências
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70
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Reimpressões e permissões
