마우스에서 흡개 성 림프혈관을 봉합하여 림프 흐름 차단
Summary
흡혈류 혈관의 외과 봉합에 의한 림프 흐름을 차단하는 프로토콜이 제시된다.
Abstract
림프관은 항원, 사이토카인 및 세포를 림프절(LN)을 배출하도록 이송하여 조직 유체 균형을 유지하고 면역 보호를 최적화하는 데 중요합니다. 림프류의 작동을 연구할 때 림프 흐름의 중단은 중요한 방법입니다. 뮤린 풋패드에서 포플라이트 림프절(pLN)까지의 퍼포성 림프관은 pLN으로 림프 배수를 위한 유일한 경로로 잘 정의됩니다. 이러한 흡혈류 혈관을 봉합하면 pLN으로의 림프 흐름을 선택적으로 방지할 수 있습니다. 이 방법은 배수 pLN, 흡신성 림프관뿐만 아니라 주변의 다른 림프관에서 림프 내피 세포에 최소한의 손상과 림프 흐름의 간섭을 허용합니다. 이 방법은 림프가 LN에서 높은 내피 정맥 (HEV) 및 chemokine 발현에 미치는 영향과 기능성 림프혈관이 없는 경우 LN을 둘러싼 지방 조직을 통해 림프가 어떻게 흐르는지 연구하는 데 사용되었습니다. 림프 기능의 중요성에 대한 인식이 증가함에 따라이 방법은 LN 미세 환경 및 면역 반응을 조절하는 림프관의 기능을 더욱 해명하기 위한 광범위한 응용 프로그램을 갖게 될 것입니다.
Introduction
림프계의 공간 조직은 세포외 유체를 효율적으로 제거하고 항원 제시 세포(AC)를 배수 LN으로 수송하는 구조적 및 기능적 지원을 제공한다. 초기 림프혈관(림프모세혈관이라고도 함)은 주변 세포외 공간에서 유체, 세포 및 기타 물질의 효과적인 수집을 용이하게 하는 불연속 세포 간 접합으로 인해 매우 투과성이 있다1. 초기 림프관은 세포간 접합, 연속 지하 막 및 림프 근육 커버리지가 있는 림프혈관을 수집하는 것으로 병합됩니다. 림프혈관을 채취하면 수거된 림프를 배수 LN으로 운반하고 결국 림프를 순환2,3로되돌려야 합니다. 림프를 배수 LN으로 추진하는 림프류를 수집하는 것은 포근림프용기4,5,6,7이다. 흡수성 림프관의 방해는 림프흐름의 기능을 연구할 때 유용한 기술인 LN으로 림프흐름을 차단할 수 있다.
이전 연구는 림프 흐름항원 및 APC를 수송에 중요 한 역할을 하는 것으로 나타났습니다., LN 항상성을 유지 뿐만 아니라. 조직 유래 APC, 전형적으로 활성화된 수지상 세포(DC)가 T세포(8)를활성화하기 위해 포구성 림프혈관을 통해 LN으로 이동하는 것으로 잘 이해된다. 미생물이나 수용성 항원과 같은 자유형 항원들이 LN 거주자 APC를 활성화하기 위해 LN으로 림프로 수동적으로 흐르고 있다는 생각은 지난 10년동안 9,10,11,12에서수용을 얻고 있다. 림프로 여행하는 자유 형태 항원은 감염 후 몇 분 정도 걸리며, LN 거주자 세포 활성화는 자극 후 20 분 이내에 발생할 수 있습니다. 이는 배수 LN9에들어가는 데 8시간 이상이 걸리는 마이그레이션 DC의 활성화보다 훨씬 빠릅니다. 림프는 면역 보호를 시작하기 위해 항원을 운반하는 것 외에도 세포카인과 DC를 LN으로 운반하여 미세 환경을 유지하고 면역 세포항상성(13,14)을지원합니다. 이전에는 포근성 림프혈관을 봉합하여 림프흐름을 차단함으로써 LN15,16, 17에동종성 T 세포 및 B 세포 호밍을 지원하는 데 필요한 HEV 표현형을 유지하는 데 림프가 필요하다는 것을입증했다. CCL21은 LN8,18에서DC 및 T 셀 포지셔닝을 지시하는 중요한 케모키네이다. 차단 림프 흐름은 LN에서 CCL21 발현을 방해하고 잠재적으로 LN19에서DC 및 T 셀 위치 및/또는 상호 작용을 방해한다. 따라서, 림프 흐름을 차단하는 것은 LN에서 면역 반응을 조절하는 LN 미세 환경을 방해함으로써 배수 LN에 항원/DC 접근을 직간접적으로 물들수 있다. 림프 흐름의 기능을 더 잘 조사하기 위해, 발패드에서 pLN까지 흡혈류 혈관을 봉합하여 마우스의 림프 흐름을 차단하는 실험프로토콜(도 1)이제시된다. 이 방법은 건강하고 병들게 하는 조건에서 림프 기능에 대한 향후 연구를위한 중요한 기술이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
림프 흐름을 차단하는 것은 건강하고 병들게 하는 조건에서 LN에 항원 전달을 조작하는 광범위한 응용 을 가질 것이다. 이 방법을 사용하여 항원 전달의 타이밍을 조절하여 지속적인 림프 흐름이 LN 을 배수하는 데 면역 반응을 어떻게 조절하는지 연구할 수 있다. 림프 흐름 중단의 이 방법은 또한 림프가 세포 구획화, 세포 활성화, 세포 이동 및 LN에서 세포 세포 상호 작용에 미치는 영향을 연구하?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 원고를 교정해 준 아바 자르디네하드에게 감사를 표한다. 이 작품은 캐나다 보건 연구소 (CIHR, PJT-156035)와 캐나다 SL 혁신 재단 (32930)과 Yujia Lin (81901576)에 의해 지원됩니다.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
Referências
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