Blockering Lymfflödet genom suturering afferenta lymfkärl hos möss
Summary
Ett protokoll för att blockera lymfa flöde genom kirurgiska suturering av afferent lymfkärl presenteras.
Abstract
Lymfkärl är avgörande för att upprätthålla vävnadsvätskan balans och optimera immunskydd genom att transportera antigener, cytokiner, och celler till dränerande lymfkörtlar (LNs). Avbrott i lymfflödet är en viktig metod när man studerar funktionen av lymfkärl. De afferenta lymfkärlen från murin footpad till popliteal lymfkörtlarna (pLNs) är väldefinierade som de enda vägarna för lymfdränage in i pLNs. Suturering dessa afferenta lymfkärl kan selektivt förhindra lymfflödet till pLNs. Denna metod möjliggör störningar i lymfflödet med minimal skada på lymfatiska endotelceller i dränerande pLN, de afferenta lymfkärlen, liksom andra lymfkärl runt området. Denna metod har använts för att studera hur lymfa påverkar höga endoteliala venules (HEV) och chemokine uttryck i LN, och hur lymfa flyter genom fettvävnaden kring LN i avsaknad av funktionella lymfkärl. Med det växande erkännandet av betydelsen av lymffunktionen kommer denna metod att ha bredare tillämpningar för att ytterligare riva upp funktionen av lymfkärl i regleringen av LN-mikromiljö och immunsvar.
Introduction
Den rumsliga organisationen av det lymfatiska systemet ger strukturella och funktionella stöd för att effektivt ta bort extracellulära vätska och transportera antigener och antigen-presentera celler (APCs) till den dränerande LNs. De inledande lymfkärl (även namngivna lymfatiska kapillärer) är mycket genomsläpplig på grund av deras diskontinuerliga intercellulära korsningar, som underlättar effektiv insamling av vätskor, celler, och andra material från omgivande extracellulära utrymmen1. De inledande lymfkärlen slås samman till att samla lymfkärl, som har snäva intercellulära korsningar, en kontinuerlig källare membran, och lymfatisk muskel täckning. Samla lymfkärl är ansvariga för transport av insamlade lymfa till dränerande LNs och så småningom återvänder lymfantill cirkulationen 2,3. De samlande lymfkärlen som driver lymfan in i den dränerande LN är de afferentalymfkärlen 4,5,6,7. Obstruktion av afferenta lymfkärl kan blockera lymfflödet i LNs, vilket är en användbar teknik när man studerar funktionen av lymfflödet.
Tidigare studier har visat att lymfflödet spelar en viktig roll i transporten av antigener och APC, samt upprätthålla LN homeostas. Det är väl underförstått att vävnadsbaserade APC-enheter, typiskt aktiverade migrerande dendritiska celler (DCs), färdas genom de afferenta lymfkärlen till LN för att aktivera T-celler8. Tanken att friform antigener, såsom mikrober eller lösliga antigener, passivt flöde med lymfa till LN för att aktivera LN-resident APC har fått acceptans under det senaste decenniet9,10,11,12. Fritt form antigener reser med lymfa ta minuter efter infektionen att resa till LN, och LN-resident cell aktivering kan ske inom 20 min efter stimuleringen. Detta är mycket snabbare än aktiveringen av migrerande DCs, som tar mer än 8 h för att komma in i dränerande LN9. Förutom att transportera antigener för att initiera immunskydd, bär lymfa också cytokiner och DCs till LN för att behålla sin mikromiljö, och för att stödja immuncell homeostas13,14. Tidigare, blockerande lymfflödet genom suturering de afferenta lymfkärl visat att lymfan krävs för att upprätthålla HEV fenotyp som krävs för att stödja homeostatiska T-cell och B-cell homing till LN15,16,17. CCL21 är en kritisk chemokine som leder DC och T cell positionering i LN8,18. Blockerande lymfflöde avbryter CCL21-uttrycket i LN och avbryter potentiellt DC- och T-cellpositionering och/eller interaktion i LN19. Blockerande lymfflöde kan således direkt eller indirekt upphäva antigen/DC-åtkomst till den dränerande LN genom att störa LN-mikromiljö som reglerar immunsvar i LN. För att bättre undersöka funktionen av lymfflödet presenteras ett experimentellt protokoll (Figur 1) för att blockera lymfflödet hos möss genom suturering av de afferenta lymfkärlen från fotplattan till pLN. Denna metod kan vara en viktig teknik för framtida studier om lymffunktion i friska och sjuka tillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Blockerande lymfflöde kommer att ha breda tillämpningar i manipulera antigen leverans till LN i friska och sjuka förhållanden. Det är möjligt att använda denna metod för att kontrollera tidpunkten för antigenleverans för att studera hur kontinuerligt lymfflöde reglerar immunsvar vid avtappning av LNs. Denna metod för lymfflödesavbrott kan också användas för att studera hur lymfan påverkar cellfackindelning, cellaktivering, cellmigration och cell-cellinteraktioner i LN.
Möss s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Ava Zardynezhad för korrekturläsning av manuskriptet. Detta arbete stöds av Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035), och Canada Foundation for Innovation for SL (32930), och av National Natural Science Foundation of China för Yujia Lin (81901576).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
Referências
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
