Overvåget maskinlæring til semi-kvantificering af ekstracellulær DNA i glomerulonefritis
Summary
Ekstracellulært DNA (ecDNA), der frigives under celledød, er proinflammatorisk og bidrager til inflammation. Måling af ecDNA på skadesstedet kan bestemme effekten af terapeutisk behandling i målorganet. Denne protokol beskriver brugen af et maskinlæringsværktøj til at automatisere måling af ecDNA i nyrevæv.
Abstract
Glomerular celledød er et patologisk træk ved myeloperoxidase anti neutrofile cytoplasmatiske antistof associeret vaskulitis (MPO-AAV). Ekstracellulær deoxyribonucleic syre (ecDNA) frigives under forskellige former for celledød, herunder apoptose, nekrose, nekroptose, neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) og pyropose. Måling af denne celledød er tidskrævende med flere forskellige biomarkører, der kræves for at identificere de forskellige biokemiske former for celledød. Måling af ecDNA udføres generelt i serum og urin som et surrogat for nyreskader, ikke i det faktiske målorgan, hvor den patologiske skade opstår. Den nuværende vanskelighed ved at undersøge ecDNA i nyrerne er manglen på metoder til formalin fast paraffin indlejret væv (FFPE) både eksperimentelt og i arkiverede humane nyre biopsier. Denne protokol indeholder en oversigt over de trin, der kræves for at plette for ecDNA i FFPE væv (både human og murine), slukke autofluorescens og måle ecDNA i de resulterende billeder ved hjælp af en maskine læring værktøj fra den offentligt tilgængelige open source ImageJ plugin trainable Weka segmentering. Trainable Weka segmentering anvendes til ecDNA inden for glomeruli, hvor programmet lærer at klassificere ecDNA. Denne klassificering anvendes på efterfølgende erhvervede nyrebilleder, hvilket reducerer behovet for manuelle anmærkninger af hvert enkelt billede. Tilpasningsevnen af den trainable Weka segmentering er påvist yderligere i nyrevæv fra eksperimentelle murine anti-MPO glomerulonefritis (GN), at identificere NETs og ecMPO, fælles patologiske bidragydere til anti-MPO GN. Denne metode giver objektiv analyse af ecDNA i nyrevæv, der klart viser effekten, hvor den trainable Weka segmentering program kan skelne ecDNA mellem sunde normale nyrevæv og syge nyrevæv. Denne protokol kan nemt tilpasses til at identificere ecDNA, NETs og ecMPO i andre organer.
Introduction
Myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmatisk antistof associeret vaskulitis (MPO-AAV) er en autoimmun sygdom, der resulterer i nyresvigt fra patologisk glomerular skade med betydelig celledød og frigivelse af deoxyribonucleic syre (DNA)1,2. DNA kan aktivere immunsystemet ved at fungere som et faresignal. Under normale sunde forhold, den nukleare placering af DNA giver beskyttelse mod eksponering for immunsystemet. Selv-DNA, der frigives ekstracellulær under enten patogene processer eller autoimmunitet ses af immunsystemet som en potent proinflammatoriske skader forbundet molekylær selvprotein (DAMP)3. Ekstra cellulære DNA (ecDNA) frigives fra døende celler gennem flere forskellige mekanismer, der er omfattet af forskellige biokemiske veje, såsom apoptose, nekroptose neutrofile ekstracellulære fælde dannelse (NETs), nekrose eller pyroptose4,,5,,6,7,8.
Vi beskriver heri metoder til plet og måle ecDNA frigivet fra døende celler i dele af formalin fast paraffin indlejret (FFPE) nyrer fra eksperimentelle anti-MPO GN og nyre biopsier fra patienter med MPO-AAV9,10. Der findes flere metoder til påvisning af cirkulerende dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og DNA-komplekser fra både serum og urin og fra in vitro-analyser11,12. Disse metoder, selv om nøjagtige ved bestemmelse af mængden af ecDNA, ikke bestemme, hvor ecDNA frigives anatomisk. Der findes metoder, der beskriver specifik måling af ecDNA,13,14f.eks. Der er ingen metode, der beskriver måling ecDNA kulminerede fra alle former for celledød i FFPE nyrer, hvor de patologiske skader opstår. Dette er vigtigt for at afgøre, om eksperimentelle terapeutiske behandlinger rydder ecDNA fra steder af patologisk skade i det faktiske målorgan.
Erhvervelsen af flere billeder fra nyreprøver skaber en stor mængde data, der analyseres almindeligt af en enkelt bruger. Dette er arbejdskrævende, tidskrævende og kan være underlagt upålidelig reproducerbarhed af andre brugere, på grund af brugerenbias. Trainable Weka segmentering er en open source software plugin til ImageJ, der bruger banebrydende bioinformatik værktøjer til at klassificere pixels ved hjælp af machine learning algoritmer15,16. Denne metode er “trainable”, hvorved den lærer af brugerens klassificering af segmenter af pixels og anvender den nye lært klassificering til andre billeder. Denne metode er baseret på fælles analyseværktøjer i ImageJ-programmet, der bruges til at “klassificere” hver pixel i et segment som tilhørende en bestemt “klasse”. Når programmet lærer “klassificeringer”, kan de bruges til at identificere andre lignende klassificerede segmenter inden for samme billede. Denne model gemmes og anvendes derefter på andre sæt billeder i det samme eksperiment.
Nuværende hindringer for bestemmelse ecDNA in situ i nyre sektioner er den endogene autofluorescens fra fiksering i formalin og arbejdskrævende analyse af billederne. Vi beskriver her, hvordan du slukker denne autofluorescens, registrerer ecDNA og bruger overvåget maskinlæring til måling af høj gennemløb af ecDNA. Vi har tidligere offentliggjort måling af NETs og ekstracellulære MPO (ecMPO) ved hjælp af en makro i ImageJ, vi nu demonstrere semi automatisering af disse metoder ved hjælp af overvåget machine learning1. Vi demonstrerer maskinlæringsværktøjets tilpasningsevne for at klassificere en alternativ plet til NET’er og ecMPO i det samme billede. Disse farvning metoder, der er beskrevet her for at opdage ecDNA, NETs og ecMPO kan oversættes til andre faste organer og sygdomme, hvor ecDNA, NETS og ecMPO spiller en rolle i at fastholde sygdomme som leddegigt og lupus17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der findes flere protokoller, der måler proinflammatoriske markører i serum og urin hos både patienter og musemodeller af glomerulonefritis. Denne beskrevne protokol giver mulighed for analyse af produkter af celledød (ecDNA, NETs og ecMPO) inden for glomerulus direkte. De mest afgørende skridt i denne protokol er væv forberedelse og billeddannelse. Det vigtigste begrænsende element ved at bruge en fluorescerende farvning metode til analyse er væv autofluorescens. Formalin fast paraffinvæv er underlagt autofluor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Monash Micro Imaging for brug af Nikon C1 opretstående konfokal laser scanning mikroskop og Monash Histology Platform til behandling af nyrevæv.
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
Referências
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
- Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
- Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
- Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
- Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
- Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
- Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
- Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
- Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).
