Glomerülonefritte Hücre Dışı DNA'nın Yarı Nicelikselleştirilmesi için Denetimli Makine Öğrenimi
Summary
Hücre ölümü sırasında salınan ekstrasellüler DNA (ekDNA) proinflamatuar ve inflamasyona katkıda bulunur. Yaralanma yerinde ekDNA ölçümü hedef organda terapötik tedavinin etkinliğini belirleyebilir. Bu protokol böbrek dokusunda ekDNA ölçümü otomatikleştirmek için bir makine öğrenme aracı nın kullanımını açıklar.
Abstract
Glomerüler hücre ölümü miyeloperoksidaz anti nötrofil sitoplazmik antikor ilişkili vaskülitin patolojik bir özelliğidir (MPO-AAV). Ekstrasellüler deoksiribonükleik asit (ekDNA) apoptoz, nekroz, nekroz, nötrofil ekstrasellüler tuzaklar (Nets) ve piroptoz gibi hücre ölümü farklı formları sırasında serbest bırakılır. Bu hücre ölümünün ölçümü, hücre ölümünün farklı biyokimyasal formlarını belirlemek için gerekli olan birkaç farklı biyobelirteçle zaman alıcıdır. EkDNA ölçümü genellikle serum ve idrarda böbrek hasarı için taşıyıcı anne olarak yapılır, patolojik yaralanmanın meydana geldiği gerçek hedef organda değil. Böbrekte ekDNA’nın araştırılmasındaki mevcut zorluk, hem deneysel hem de arşivlenmiş insan böbrek biyopsilerinde formalin sabit parafin gömülü doku (FFPE) yöntemlerinin olmamasıdır. Bu protokol FFPE dokusunda ekDNA için leke için gerekli adımların bir özetini sağlar (hem insan hem de murine), otofloresan sökmek ve kamuya açık kaynak ImageJ plugin eğitilebilir Weka segmentasyonu bir makine öğrenme aracı kullanarak ortaya çıkan görüntülerde ekDNA ölçmek. Eğitilebilir Weka segmentasyonu, programın ekDNA sınıflandırmayı öğrendiği glomerüli içinde ekDNA’ya uygulanır. Bu sınıflandırıcı sonraki elde edilen böbrek görüntüleri uygulanır, her bir görüntümanuel ek açıklamalar için ihtiyacı azaltarak. Eğitilebilir Weka segmentasyonunun uyarlanabilirliği, deneysel murine anti-MPO glomerülonefrit (GN) böbrek dokusunda, anti-MPO GN’ye ortak patolojik katkıda bulunan NET’leri ve ecMPO’yu tanımlamak için daha fazla gösterilmiştir. Bu yöntem, eğitilebilir Weka segmentasyon programının sağlıklı normal böbrek dokusu ile hastalıklı böbrek dokusu arasında ekDNA’yı ayırt edebilmesinin etkinliğini açıkça gösteren böbrek dokusundaki ekDNA’nın objektif analizini sağlar. Bu protokol diğer organlardaki ecDNA, NET ve ECMPO’ları tanımlamak için kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Myeloperoksidaz anti nötrofil sitoplazmik antikor ilişkili vaskülit (MPO-AAV) önemli hücre ölümü ve deoksiribonükleik asit salınımı ile patolojik glomerüler yaralanma böbrek yetmezliği ile sonuçlanan bir otoimmün hastalıktır (DNA)1,2. DNA bir tehlike sinyali gibi davranarak bağışıklık sistemini aktive edebilir. Normal sağlıklı koşullar altında, DNA’nın nükleer konumu bağışıklık sistemine maruz kalma koruma sağlar. Patojenik süreçler veya otoimmünite sırasında hücre dışı olarak salınan kendi KENDINE DNA bağışıklık sistemi tarafından moleküler öz protein (DAMP) ile ilişkili güçlü bir proinflamatuar hasar olarak görülür3. Ekstra hücresel DNA (ekDNA) apoptoz, nektoz nötrofil ekstrasellüler tuzak oluşumu (NET), nekroz veya piroptoz4,,5,6,7,8gibi farklı biyokimyasal yollar tarafından yönetilen çeşitli farklı mekanizmalar aracılığıyla ölmekte olan hücrelerden serbest bırakılır.
Burada, deneysel anti-MPO GN ve MPO-AAV9,hastalarından alınan böbrek biyopsilerinden formalin sabit parafin (FFPE) böbrekbölümlerinde ölmekte olan hücrelerden salınan ekDNA’yı boyama ve ölçme yöntemlerini tanımlıyoruz,10. Birden fazla yöntem çift iplikçikli DNA (dsDNA) ve DNA kompleksleri hem serum ve idrar ve in vitro tahliller11,,12dolaşan tespiti için var . Bu yöntemler, ekDNA miktarını belirlemede doğru olmakla birlikte, ekDNA’nın anatomik olarak nerede salınacağını belirlemez. Apoptoz için tunel ve hücre enkazı ölçümü13,14gibi ecDNA özel ölçüm açıklayan yöntemler vardır. Patolojik hasarın meydana geldiği FFPE böbreklerinde hücre ölümünün her türlüsden kaynaklanan ekDNA ölçümü ile sonuçlanan bir yöntem yoktur. Bu deneysel terapötik tedaviler gerçek hedef organpatolojik yaralanma sitelerinden ekDNA temizleyerek olup olmadığını belirlemek için önemlidir.
Böbrek örneklerinden birden fazla görüntü elde edilmesi, tek bir kullanıcı tarafından yaygın olarak analiz edilen yüksek hacimli veri oluşturur. Bu emek yoğun, zaman alıcı ve diğer kullanıcılar tarafından güvenilmez tekrarlanabilirlik tabi olabilir, kullanıcı önyargı nedeniyle. Trainable Weka segmentasyon machine learning algoritmaları15,16kullanarak piksel sınıflandırmak için kesme kenarı biyoinformatik araçları kullanan ImageJ için bir açık kaynak yazılım eklentisi . Bu yöntem, kullanıcının piksel segmentlerini sınıflandırmasından ders aldığı ve yeni öğrenilen sınıflandırmayı diğer görüntülere uyguladığı “eğitilebilir”dir. Bu yöntem, ImageJ programında, bir segmentteki her pikseli belirli bir “sınıfa” ait olarak “sınıflandırmak” için kullanılan ortak çözümleme araçlarına dayanır. Program “sınıflandırıcıları” öğrendikten sonra, aynı görüntü deki diğer benzer sınıflandırılmış bölümleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu model daha sonra kaydedilir ve aynı denemedeki diğer görüntü kümelerine uygulanır.
Böbrek kesitlerinde yerinde ekDNA’nın belirlenmesinin önündeki mevcut engeller formalinde fiksasyondan kaynaklanan endojen otofloresans ve görüntülerin emek yoğun analizidir. Burada bu otofloresansı nasıl bastırabileceğimizi, ekDNA’yı nasıl tespit edebileceğimizi ve ekDNA’nın yüksek iş elde ölçümü için denetimli makine öğrenimini nasıl kullanacağımızı burada açıklıyoruz. Biz daha önce ImageJ bir makro kullanarak NETs ve ekstrasellüler MPO (ecMPO) ölçümü yayınladık, şimdi denetlenen makine öğrenme1kullanarak bu yöntemlerin yarı otomasyon göstermek. Biz aynı görüntü içinde NETs ve ecMPO için alternatif bir leke sınıflandırmak için, makine öğrenme aracının adaptasyon yeteneğini göstermektedir. EcDNA, NET’lerin ve ecMPO’nun saptanması için burada açıklanan bu boyama yöntemleri, ekDNA, NETS ve ecMPO’nun romatoid artrit ve lupus gibi hastalıkların devamında rol oynadığı diğer katı organlara ve hastalıklara,18çevrilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glomerülonefritin hem hastaların serum hem de idrarında proinflamatuar belirteçleri ölçen çoklu protokoller mevcuttur. Bu açıklanan protokol, glomerulus içindeki hücre ölümü ürünlerinin (ecDNA, NETs ve ECMPO) doğrudan analizini sağlar. Bu protokoldeki en önemli adımlar doku hazırlama ve görüntülemedir. Analiz için floresan boyama yöntemi kullanarak önemli kısıtlayıcı unsur doku otofloresanolduğunu. Formalin sabit parafin dokusu belirli floresan boyama gizleyebilir otofloresan tabidir. Slay…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nikon C1 dik konfokal lazer tarama mikroskobu ve böbrek dokusunun işlenmesi için Monash Histoloji Platformu’nun kullanımı için Monash Mikro Görüntüleme’yi kabul ediyoruz.
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
Referências
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
- Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
- Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
- Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
- Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
- Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
- Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
- Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
- Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).
