Veiledet maskinlæring for semikvantifisering av ekstracellulært DNA i Glomerulonefrit
Summary
Ekstracellulært DNA (ecDNA) utgitt under celledød er proinflammatorisk og bidrar til betennelse. Måling av ecDNA på skadestedet kan bestemme effekten av terapeutisk behandling i målorganet. Denne protokollen beskriver bruken av et maskinlæringsverktøy for å automatisere måling av ecDNA i nyrevev.
Abstract
Glomerulær celledød er et patologisk trekk ved myeloperoxidase anti nøytrofilt cytoplasmatisk antistoff assosiert vaskulitt (MPO-AAV). Ekstracellulær deoksyribonuklesyre (ecDNA) frigjøres under ulike former for celledød, inkludert apoptose, nekrose, nøytrofil ekstracellulære feller (NETs) og pyroptose. Måling av denne celledøden er tidkrevende med flere forskjellige biomarkører som kreves for å identifisere de forskjellige biokjemiske former for celledød. Måling av ecDNA utføres vanligvis i serum og urin som surrogat for nyreskade, ikke i selve målorganet der den patologiske skaden oppstår. Den nåværende vanskeligheten med å undersøke ecDNA i nyrene er mangelen på metoder for formalin fast parafin innebygd vev (FFPE) både eksperimentelt og i arkiverte menneskelige nyrebiopsier. Denne protokollen gir et sammendrag av trinnene som kreves for å flekke for ecDNA i FFPE-vev (både menneskelig og murine), slukke autofluorescens og måle ecDNA i de resulterende bildene ved hjelp av et maskinlæringsverktøy fra den offentlig tilgjengelige åpen kildekode ImageJ plugin trainable Weka segmentering. Trainable Weka segmentering brukes på ecDNA i glomeruli hvor programmet lærer å klassifisere ecDNA. Denne klassifikatoren brukes på etterfølgende ervervede nyrebilder, noe som reduserer behovet for manuelle merknader av hvert enkelt bilde. Tilpasningsevnen til den togbare Weka-segmenteringen er demonstrert videre i nyrevev fra eksperimentell murine anti-MPO glomerulonefritt (GN), for å identifisere NETs og ecMPO, vanlige patologiske bidragsytere til anti-MPO GN. Denne metoden gir objektiv analyse av ecDNA i nyrevev som viser tydelig effekten der det trainable Weka segmenteringsprogrammet kan skille ecDNA mellom sunt normalt nyrevev og sykt nyrevev. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å identifisere ecDNA, NETs og ecMPO i andre organer.
Introduction
Myeloperoxidase anti nøytrofilt cytoplasmatisk antistoff assosiert vaskulitt (MPO-AAV) er en autoimmun sykdom som resulterer i nyresvikt fra patologisk glomerulær skade med betydelig celledød og frigjøring av deoksyribonuklesyre (DNA)1,2. DNA kan aktivere immunsystemet ved å fungere som et faresignal. Under normale sunne forhold gir den kjernefysiske plasseringen av DNA beskyttelse mot eksponering for immunsystemet. Selv-DNA som frigjøres ekstracellulært under enten patogene prosesser eller autoimmunitet er sett av immunsystemet som en potent proinflammatorisk skade assosiert molekylært selvprotein (DAMP)3. Ekstra cellulær DNA (ecDNA) frigjøres fra døende celler gjennom flere forskjellige mekanismer som styres av distinkte biokjemiske veier, som apoptose, nekrotose nøytrofil ekstracellulær felledannelse (NETs), nekrose eller pyroptose4,5,6,7,8.
Vi beskriver heri metoder for å flekke og måle ecDNA utgitt fra døende celler i deler av formalin fast parafin innebygd (FFPE) nyrer fra eksperimentelle anti-MPO GN og nyre biopsier fra pasienter med MPO-AAV9,10. Det finnes flere metoder for påvisning av sirkulerende dobbeltstrandet DNA (dsDNA) og DNA-komplekser fra både serum og urin og fra in vitro-analyser11,,12. Disse metodene, selv om de er nøyaktige for å bestemme mengden ecDNA, bestemmer ikke hvor ecDNA frigjøres anatomisk. Det finnes metoder som beskriver spesifikk måling av ecDNA som tunel for apoptose og måling av cellerester13,14. Det finnes ingen metode som beskriver måling av ecDNA som kulminerte fra alle former for celledød i FFPE-nyrer hvor den patologiske skaden oppstår. Dette er viktig for å avgjøre om eksperimentelle terapeutiske behandlinger fjerner ecDNA fra steder av patologisk skade i selve målorganet.
Oppkjøpet av flere bilder fra nyreprøver skaper et høyt volum data som analyseres ofte av en enkelt bruker. Dette er arbeidskrevende, tidkrevende og kan være underlagt upålitelig reproduserbarhet av andre brukere, på grunn av brukerbias. Trainable Weka segmentering er en åpen kildekode programvare plugin for ImageJ som bruker cutting edge bioinformatikk verktøy for å klassifisere piksler ved hjelp av maskinlæringalgoritmer 15,16. Denne metoden er “trainable” der den lærer av brukerens klassifisering av segmenter av piksler og bruker den nye lært klassifisering til andre bilder. Denne metoden er avhengig av vanlige analyseverktøy i ImageJ-programmet som brukes til å “klassifisere” hver piksel i et segment som tilhører en bestemt “klasse”. Når programmet lærer “klassifikatorer”, kan de brukes til å identifisere andre lignende klassifiserte segmenter i samme bilde. Denne modellen lagres og brukes deretter på andre sett med bilder i samme eksperiment.
Nåværende hindringer for å bestemme ecDNA in situ i nyreseksjoner er endogene autofluorescens fra fiksering i formalin og den arbeidsintensive analysen av bildene. Vi beskriver her hvordan å slukke denne autofluorescensen, oppdage ecDNA, og bruke overvåket maskinlæring for høy gjennomstrømningsmåling av ecDNA. Vi har tidligere publisert måling av NETs og ekstracellulær MPO (ecMPO) ved hjelp av en makro i ImageJ, vi viser nå semi automatisering av disse metodene ved hjelp av overvåket maskinlæring1. Vi demonstrerer tilpasningsevnen til maskinlæringsverktøyet, for å klassifisere en alternativ flekk for NETs og ecMPO i samme bilde. Disse fargemetodene som er beskrevet her for å oppdage ecDNA, NETs og ecMPO kan oversettes til andre faste organer og sykdommer der ecDNA, NETS og ecMPO spiller en rolle i å opprettholde sykdom som revmatoid artritt og lupus17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finnes flere protokoller som måler proinflammatoriske markører i serum og urin av både pasienter og musemodeller av glomerulonefritt. Denne beskrevne protokollen tillater analyse av produkter av celledød (ecDNA, NETs og ecMPO) i glomerulus direkte. De viktigste trinnene i denne protokollen er vevspreparatet og bildet. Det viktigste begrensende elementet ved å bruke en fluorescerende fargemetode for analyse er vevet autofluorescens. Formalin fast parafinvev er gjenstand for autofluorescens som kan skjule spesifik…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner Monash Micro Imaging for bruk av Nikon C1 oppreist konfikal laserskanning mikroskop og Monash Histology Platform for behandling av nyrevev.
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
Referências
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
- Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
- Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
- Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
- Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
- Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
- Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
- Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
- Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).
