斑马鱼中具有功能化荧光硅纳米粒子的异种移植人类癌细胞的Vivo靶向
Summary
这里描述的方法是利用斑马鱼胚胎研究功能化纳米粒子在体内瞄准人类癌细胞的能力。此方法允许评估和选择最佳纳米粒子，供将来在大型动物和临床试验中进行测试。
Abstract
开发能够检测、瞄准和破坏癌细胞的纳米粒子在纳米医学领域有着浓厚的兴趣。将纳米技术与生物医学应用衔接，需要体内动物模型。小鼠代表传统的动物模型进行临床前测试;然而，由于每个母亲的后代有限，小鼠的保留费用相对昂贵，实验周期也很长。斑马鱼已成为一个强大的模型系统，用于发展和生物医学研究，包括癌症研究。特别是，由于其光学透明度和快速发展，斑马鱼胚胎非常适合实时体内监测癌细胞的行为及其与微环境的相互作用。该方法被开发成在透明卡斯珀斑马鱼胚胎中依次引入人类癌细胞和功能化纳米Casper粒子，并实时监测纳米粒子对癌细胞的体内识别和靶向。这种优化的协议表明，荧光标记的纳米粒子，与叶酸组功能化，可以专门识别和靶向转移性人类宫颈上皮癌细胞标记不同的荧光色素。识别和靶向过程可尽早在纳米粒子的注射后 30 分钟进行。整个实验只需要繁殖几对成年鱼，只需不到4天才能完成。此外，斑马鱼胚胎缺乏功能适应性免疫系统，允许广泛人类癌细胞的移植。因此，此处描述的协议的效用使纳米粒子能够对不同类型的人类癌细胞进行测试，从而促进在每个特定癌症环境中选择最佳纳米粒子，供将来在哺乳动物和诊所进行测试。
Introduction
能够检测、瞄准和破坏癌细胞的纳米粒子的发育引起了物理学家和生物医学研究人员的高度重视。纳米药物的出现导致了几种纳米粒子的发展，例如那些与靶向配体和/或化疗药物,1、2、32结合的粒子。纳米粒子的附加特性使其能够与生物系统相互作用，高效、精确地传感和监测生物事件以及治疗应用。黄金和氧化铁纳米粒子主要用于计算机断层扫描和磁共振成像应用。虽然金和氧化铁纳米粒子的酶活动允许通过色度测定检测癌细胞，但荧光纳米粒子非常适合体内成像应用4。其中，超亮荧光纳米粒子特别有益，因为它们能够用更少的颗粒和减少毒性早期检测癌症。
尽管有这些优点，纳米粒子需要利用体内动物模型进行实验，以选择合适的纳米材料和优化合成过程。此外，就像药物一样，纳米粒子依靠动物模型进行临床前测试，以确定其功效和毒性。使用最广泛的临床前模型是老鼠，它是一种哺乳动物，其维护成本相对较高。对于癌症研究，无论是基因工程小鼠还是异种移植小鼠，通常使用6,6，7。这些实验的长短通常从几周到几个月。特别是，对于癌症转移研究，癌细胞被直接注射到小鼠的循环系统中，如尾静脉和静脉8，9，10。,9,10这些模型只代表肿瘤细胞外在和殖民远距离器官时转移的结束阶段。此外，由于能见度问题，监测小鼠肿瘤细胞的肿瘤细胞迁移和纳米粒子靶向尤其具有挑战性。
斑马鱼（Danio rerio）由于其高繁殖性、低成本、快速发展、光学透明度和遗传保护，,已成为癌症研究的强大脊椎动物系统。斑马鱼比小鼠模型的另一个优点是鱼卵在子宫外受精，这使得胚胎在整个发育过程中受到监测。斑马鱼胚胎发育迅速，在受精后24小时内，脊椎动物体平面已形成13种。到72马力，卵子从卵子孵化，从胚胎过渡到煎蛋阶段。斑马鱼的透明度，特别是14，提供了一个独特的机会，可视化癌细胞的迁移，并识别和定位纳米粒子在活的动物。 Casper最后，斑马鱼以48马力发展其先天免疫系统，适应性免疫系统落后，在受精后28天才发挥作用。这种时间差距是将各种类型的人类癌细胞移植到斑马鱼胚胎而不经历免疫排斥的理想之选。
本文介绍，利用斑马鱼的透明度和快速发展，通过荧光纳米粒子在体内识别并定位人类癌细胞。在这项测定中，人类宫颈癌细胞（HeLa细胞）被基因工程表达红色荧光蛋白被注射到48马力胚胎的腹腔内血管化区域。20-24小时后，HeLa细胞已经通过鱼类循环系统扩散到整个胚胎。具有明显转移的胚胎被微缩，直接在眼睛后面用±0.5 nL的纳米粒子溶液，富毛细管床就位于眼睛后面。利用这种技术，超亮荧光二氧化硅纳米粒子可以快速瞄准 HeLa 细胞，在注射后 20-30 分钟。由于其简单性和有效性，斑马鱼代表了一个强大的体内模型，以测试各种纳米粒子的能力，他们的目标特定的癌细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处描述的协议利用斑马鱼作为体内系统来测试纳米粒子识别和靶向转移性人类癌细胞的能力。有几个因素会影响实验的成功执行。首先，胚胎需要在48马力时完全发育。胚胎的正确发育阶段使它们能够忍受人类癌细胞的移植并存活下来。与年龄较大、发育较发达的胚胎相比，48马力以下的胚胎存活率要低得多。其次，癌细胞应尽可能保持健康，确保它们：1） 在指数生长阶段21，2）2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢凯莉·史密斯女士、郭女士和亚历山大·弗洛鲁先生对手稿进行校对。H.F.感谢国家卫生和、美国癌症协会（RSG-17-204 01-TBG）和圣鲍德里克基金会的资助。F.J.F.L.承认波士顿大学创新中心-布纳诺癌症纳米技术跨学科培训（XTNC）的奖学金。I.S 确认 NSF 支持（授权 CBET 1605405）和 NIH R41AI142890。
Materials
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
Referências
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