제브라피시에 기능성 형광 실리카 나노입자를 가진 제노이식 인간 암세포의 생체 내 표적화
Summary
여기에 설명된 제브라피쉬 배아를 활용하여 생체내에서 인간 암세포를 표적으로 하는 기능성 나노입자의 능력을 연구하는 방법이다. 이 방법을 통해 대규모 동물 및 임상 시험에서 향후 테스트를 위한 최적의 나노입자의 평가 및 선택을 가능하게 합니다.
Abstract
암세포를 검출, 표적화 및 파괴할 수 있는 나노입자를 개발하는 것은 나노의학 분야에 큰 관심을 가지고 있습니다. 생체 내 동물 모델은 나노 기술을 생체 의학 응용 분야에 연결하는 데 필요합니다. 마우스는 전임상 테스트를 위한 전통적인 동물 모델을 나타낸다; 그러나, 마우스는 각 어머니에게서 제한된 자손 때문에 오래 실험 주기를 유지하고 지키기 위하여 상대적으로 비쌉니다. 제브라피쉬는 암 연구를 포함한 발달 및 생물 의학 연구를 위한 강력한 모델 시스템으로 부상했습니다. 특히, 그 광학 투명성과 급속한 발달로 인해, 제브라피쉬 배아는 암세포의 행동과 그들의 마이크로 환경과의 상호 작용의 생체 내 모니터링에 실시간으로 적합합니다. 이 방법은 투명한 캐스퍼 제브라피시 배아에서 인간 암세포와 기능성 나노입자를 순차적으로 도입하고 나노입자에 의한 암세포의 생체 인식 및 표적화를 실시간으로 모니터링하기 위해 개발되었다. 이 최적화된 프로토콜은 엽산기 그룹으로 기능화되는 형광으로 표지된 나노입자가 다른 형광크롬으로 표지된 전이성 인간 자궁경부 상피암세포를 구체적으로 인식하고 표적으로 삼을 수 있음을 보여준다. 인식 및 표적화 공정은 테스트된 나노입자의 30분 후 사출이 조기에 발생할 수 있다. 전체 실험은 성인 물고기의 몇 쌍의 번식을 필요로하고 완료하는 데 4 일 미만걸립니다. 더욱이, 제브라피시 배아는 기능적인 적응성 면역 계통이 부족하여 광범위한 인간 암세포를 이식할 수 있습니다. 따라서, 여기에 설명된 프로토콜의 유용성은 포유류와 클리닉에서 향후 검사를 위해 각 특정 암 맥락에서 최적의 나노 입자의 선택을 용이하게하는 다양한 유형의 인간 암세포에 대한 나노 입자의 테스트를 가능하게 한다.
Introduction
암세포를 검출, 표적화 및 파괴할 수 있는 나노입자의 개발은 물리학자와 생물의학 연구자 모두에게 큰 관심사입니다. 나노의학의 출현은 리간드 및/또는 화학요법 약물1,,2,,3을표적으로 하는 것과 같은 여러 나노입자의 개발로 이어졌다. 나노 입자의 추가 특성은 치료 응용 프로그램과 함께 고효율 및 정확도로 생물학적 사건을 감지하고 모니터링하면서 생물학적 시스템과의 상호 작용을 가능하게합니다. 금과 산화철 나노입자는 주로 컴퓨터 단층 촬영 및 자기 공명 이미징 응용 분야에서 각각 사용됩니다. 금과 산화철 나노입자의 효소 활동은 착색 분석법을 통해 암세포의 검출을 허용하지만, 형광 나노입자는 생체 내 이미징 응용 4에적합합니다. 그 중에서도 초브라이트 형광 나노 입자는 입자가 적고 독성이 감소하여 암을 조기에 검출할 수 있기 때문에 특히 유용합니다5.
이러한 장점에도 불구하고, 나노 입자는 적절한 나노 물질 및 합성 공정의 최적화를 위해 생체 내 동물 모델을 사용하여 실험을 필요로 한다. 또한 약물과 마찬가지로 나노 입자는 전임상 테스트를 위해 동물 모델에 의존하여 효능과 독성을 결정합니다. 가장 널리 사용되는 전임상 모델은 마우스로, 이는 상대적으로 높은 비용으로 유지보수가 오는 포유류입니다. 암 연구를 위해, 유전자 조작된 마우스 또는 이노이식 마우스는 전형적으로6,7를7이용한다. 이 실험의 길이는 수시로 주에서 달에 걸쳐 있습니다. 특히, 암 전이 연구를 위해, 암세포는 꼬리 정맥 및 비장8,,9,,10과 같은 위치에서 마우스의 순환 시스템에 직접 주입된다. 이 모형은 종양 세포가 멀리 있는 기관을 사치화하고 식민지화할 때 전이의 끝 단계를 나타냅니다. 더욱이, 가시성 문제로 인해, 마우스에 있는 종양 세포의 종양 세포 이동 및 나노 입자 표적을 감시하는 것은 특히 도전적입니다.
제브라피쉬(Daniorerio)는높은 균류, 저비용, 신속한 발달, 광학 투명성 및 유전적보존(11,,12)으로인해 암 연구를 위한 강력한 척추동물 시스템이 되었다. 마우스 모델에 비해 zebrafish의 또 다른 장점은 물고기 계란 ex utero의 수정으로, 이는 배아가 그들의 발달 내내 감시될 수 있게 합니다. 배아 발달은 얼룩말에서 급속하고, 24 시간 이내에 후유증 (hpf), 척추 동물 바디 플레인은 이미형성했다 13. 72 hpf에 의해, 계란은 초리온에서 부화되어 배아에서 튀김 단계로 전환됩니다. 특히14개의제브라피쉬균의 투명성은 암세포의 이주와 살아있는 동물의 나노입자에 의한 인식과 표적화를 시각화할 수 있는 독특한 기회를 제공한다. Casper 마지막으로, 제브라피쉬는 48hpf로 타고난 면역체계를 개발하며 적응형 면역체계가 뒤쳐지고 28일 후유분화15일에만기능성으로 변한다. 이 시간 간격은 면역 거부를 경험하지 않고 제브라피시 배아로 인간 암세포의 각종 모형의 이식에 이상적입니다.
여기서 설명된 방법은 제브라피쉬의 투명성과 신속한 발달을 활용하여 생체내형 나노입자에 의한 인간 암세포의 인식 및 표적화를 입증하는 방법이다. 이 분석에서, 적색 형광 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 인간 자궁경부암세포(HeLa 세포)는 48hpf 배아의 생체내내혈관내로 주입되었다. 20-24 시간 후에, HeLa 세포는 이미 물고기 순환 계통을 통해 배아를 통해 퍼졌습니다. 명백한 전이를 가진 태아는 부유한 모세관 침대가 있는 눈 의 뒤에 나노 입자 용액의 ~0.5 nL로 마이크로인주사되었습니다. 이 기술을 사용하여, 초브라이트 형광 실리카 나노 입자는 20-30 분 사후 주입으로 빨리 HeLa 세포를 표적으로 할 수 있습니다. 그 단순성과 효과 로 인해, 제브라피쉬는 특정 암세포를 표적으로 하는 그들의 능력을 위해 다양한 나노 입자를 시험하는 강력한 생체 내 모형을 나타냅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 설명된 프로토콜은 나노입자가 전이성 인간 암세포를 인식하고 표적으로 하는 능력을 시험하기 위해 생체 내 시스템으로 제브라피쉬를 활용한다. 실험의 성공적인 실행에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 요인이 있습니다. 첫째, 배아는 48hpf에서 완전히 개발되어야 합니다. 배아의 올바른 발달 단계는 인간 적인 암세포의 이식을 견디고 살아남을 수 있게 합니다. 48 hpf 미만의 배아는 더 오래?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 케일리 스미스 양, 로렌 곽 씨, 그리고 원고를 교정한 알렉산더 플로루씨에게 감사를 표합니다. H.F.는 NIH(CA134743 및 CA215059), 미국 암 학회(RSG-17-204 01-TBG), 세인트 볼드릭 재단의 보조금 지원을 인정합니다. F.J.F.L.은 보스턴 대학 혁신 센터-부나노 암용 나노 기술 (XTNC)의 교차 징계 교육에서 펠로우십을 인정합니다. I.S는 NSF 지원(CBET 1605405) 및 NIH R41AI142890을 인정합니다.
Materials
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
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