In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Fluorescente Sílica Nanopartículas em Zebrafish
Summary
Descrito aqui é um método para utilizar embriões de zebrafish para estudar a capacidade de nanopartículas funcionalizadas para atingir células cancerígenas humanas in vivo. Este método permite a avaliação e seleção de nanopartículas ideais para testes futuros em animais de grande porte e em ensaios clínicos.
Abstract
Desenvolver nanopartículas capazes de detectar, atingir e destruir células cancerígenas é de grande interesse no campo da nanomedicina. Modelos in vivo animais são necessários para fazer a ponte da nanotecnologia à sua aplicação biomédica. O camundongo representa o modelo animal tradicional para testes pré-clínicos; no entanto, os ratos são relativamente caros de manter e têm longos ciclos experimentais devido à prole limitada de cada mãe. O zebrafish emergiu como um poderoso sistema modelo para pesquisas biomédicas e de desenvolvimento, incluindo pesquisas sobre câncer. Em particular, devido à sua transparência óptica e rápido desenvolvimento, os embriões de zebrafish são adequados para o monitoramento in vivo em tempo real do comportamento das células cancerígenas e suas interações com seu microambiente. Este método foi desenvolvido para introduzir sequencialmente células cancerígenas humanas e nanopartículas funcionalizadas em embriões transparentes de zebrafish Casper e monitorar o reconhecimento in vivo e o direcionamento das células cancerosas por nanopartículas em tempo real. Este protocolo otimizado mostra que nanopartículas fluorescentes rotuladas, que são funcionalizadas com grupos de folato, podem reconhecer e atingir especificamente células cancerígenas colossticas do colo do útero, rotuladas com um fluorocromo diferente. O processo de reconhecimento e segmentação pode ocorrer já em 30 minutos de pós-injeção das nanopartículas testadas. Todo o experimento requer apenas a criação de alguns pares de peixes adultos e leva menos de 4 dias para ser concluído. Além disso, os embriões de zebrafish carecem de um sistema imunológico adaptativo funcional, permitindo o engrafamento de uma ampla gama de células cancerígenas humanas. Assim, a utilidade do protocolo aqui descrito permite o teste de nanopartículas em vários tipos de células cancerígenas humanas, facilitando a seleção de nanopartículas ideais em cada contexto específico de câncer para testes futuros em mamíferos e na clínica.
Introduction
O desenvolvimento de nanopartículas capazes de detectar, direcionar e destruir células cancerígenas é de grande interesse tanto para físicos quanto para pesquisadores biomédicos. O surgimento da nanomedicina levou ao desenvolvimento de várias nanopartículas, como aquelas conjugadas com ligantes de alvo e/ou quimioterapia1,,2,,3. As propriedades adicionadas das nanopartículas permitem sua interação com o sistema biológico, detectando e monitorando eventos biológicos com alta eficiência e precisão, juntamente com aplicações terapêuticas. As nanopartículas de óxido de ouro e ferro são usadas principalmente em tomografia computadorizada e aplicações de ressonância magnética, respectivamente. Enquanto as atividades enzimáticas das nanopartículas de óxido de ferro e ouro permitem a detecção de células cancerosas através de assins de assinso colorimétricos, as nanopartículas fluorescentes são adequadas para aplicações de imagem in vivo4. Entre elas, as nanopartículas fluorescentes ultra-francas são particularmente benéficas, devido à sua capacidade de detectar cânceres precocemente com menos partículas e toxicidades reduzidas5.
Apesar dessas vantagens, as nanopartículas requerem experimentação utilizando modelos in vivo animais para seleção de nanomateriais adequados e otimização do processo de síntese. Além disso, assim como as drogas, as nanopartículas dependem de modelos animais para testes pré-clínicos para determinar sua eficácia e toxicidades. O modelo pré-clínico mais utilizado é o rato, que é um mamífero cuja manutenção tem um custo relativamente alto. Para estudos de câncer, camundongos geneticamente modificados ou camundongos xenógrafos são tipicamente usados6,,7. A duração desses experimentos geralmente se estende de semanas a meses. Em particular, para estudos de metástase do câncer, as células cancerígenas são injetadas diretamente no sistema circulatório dos camundongos em locais como veias traseiras e baços8,,9,,10. Esses modelos representam apenas os estágios finais da metástase quando as células tumorais extravasam e colonizam órgãos distantes. Além disso, devido a problemas de visibilidade, é particularmente desafiador monitorar a migração de células tumorais e o direcionamento de nanopartículas de células tumorais em camundongos.
O zebrafish (Danio rerio) tornou-se um poderoso sistema vertebrado para a pesquisa do câncer devido à sua alta fecundidade, baixo custo, desenvolvimento rápido, transparência óptica e conservações genéticas11,12. Outra vantagem do zebrafish sobre o modelo de camundongos é a fertilização dos ovos de peixe ex utero, o que permite que os embriões sejam monitorados durante todo o seu desenvolvimento. O desenvolvimento embrionário é rápido em zebrafish, e dentro de 24 horas de pós-fertilização (hpf), o plano corporal vertebrado já formou13. Por 72 hpf, os ovos são eclodidos do acorde, transitando do embrionário para o estágio de fritura. A transparência do zebrafish, a cepa Casper em particular14,oferece uma oportunidade única para visualizar a migração de células cancerígenas e seu reconhecimento e direcionamento por nanopartículas em um animal vivo. Finalmente, os zebrafish desenvolvem seu sistema imunológico inato em 48 hpf, com o sistema imunológico adaptativo ficando para trás e ficando funcional apenas aos 28 dias após a fertilização15. Esta lacuna de tempo é ideal para o transplante de vários tipos de células cancerígenas humanas em embriões de zebrafish sem experimentar rejeições imunológicas.
Descrito aqui é um método que aproveita a transparência e o rápido desenvolvimento do zebrafish para demonstrar o reconhecimento e direcionamento das células cancerígenas humanas por nanopartículas fluorescentes in vivo. Neste ensaio, células cancerígenas cervicais humanas (células HeLa) geneticamente projetadas para expressar uma proteína fluorescente vermelha foram injetadas na área vascularizada na cavidade perivitelline de 48 hpf embriões. Após 20-24 h, as células HeLa já haviam se espalhado pelos embriões através do sistema circulatório de peixes. Embriões com metástase aparente foram microinjetados com ~0,5 nL de uma solução de nanopartículas logo atrás do olho, onde está localizado o rico leito capilar. Usando esta técnica, as nanopartículas de sílica fluorescentes ultrabright podem atingir células HeLa tão rapidamente quanto 20-30 min de pós-injeção. Devido à sua simplicidade e eficácia, o zebrafish representa um modelo in vivo robusto para testar uma variedade de nanopartículas por sua capacidade de atingir células cancerígenas específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui utiliza o zebrafish como um sistema in vivo para testar a capacidade das nanopartículas de reconhecer e atingir células cancerígenas metastáticas. Vários fatores podem impactar a execução bem sucedida dos experimentos. Primeiro, os embriões precisam ser totalmente desenvolvidos a 48 hpf. O estágio correto de desenvolvimento dos embriões permite que eles resistam e sobrevivam ao transplante de células cancerígenas humanas. Embriões com menos de 48 cv têm uma taxa de sobrevivência s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem à Srta. Kaylee Smith, Sra. Lauren Kwok e Sr. Alexander Floru por revisarem o manuscrito. H.F. reconhece o apoio de subvenções do NIH (CA134743 e CA215059), da American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) e da Fundação St. Baldrick. F.J.F.L. reconhece uma bolsa de estudos do Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinar Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). O I.S reconhece o suporte à NSF (conceder CBET 1605405) e o NIH R41AI142890.
Materials
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
Referências
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