Beskrivs här är en metod för att utnyttja zebrafisk embryon för att studera förmågan hos funktionaliserade nanopartiklar att rikta mänskliga cancerceller in vivo. Denna metod möjliggör utvärdering och urval av optimala nanopartiklar för framtida tester på stora djur och i kliniska prövningar.
Att utveckla nanopartiklar som kan upptäcka, rikta in sig på och förstöra cancerceller är av stort intresse inom nanomedicinens område. In vivo djurmodeller krävs för att överbrygga nanotekniken till dess biomedicinska tillämpning. Musen representerar den traditionella djurmodellen för preklinisk testning; mus är dock relativt dyra att behålla och har långa experimentella cykler på grund av den begränsade avkomman från varje mor. Zebrafisken har vuxit fram som ett kraftfullt modellsystem för utvecklings- och biomedicinsk forskning, inklusive cancerforskning. Särskilt på grund av sin optiska öppenhet och snabba utveckling, zebrafisk embryon är väl lämpade för realtid in vivo övervakning av beteendet hos cancerceller och deras interaktioner med deras mikromiljö. Denna metod har utvecklats för att sekventiellt införa mänskliga cancerceller och funktionaliserade nanopartiklar i transparenta Casper zebrafish embryon och övervaka in vivo erkännande och inriktning av cancercellerna av nanopartiklar i realtid. Detta optimerade protokoll visar att fluorescerande märkta nanopartiklar, som är funktionaliserade med folatgrupper, specifikt kan känna igen och rikta metastaserande mänskliga livmoderhalscancer epitelceller märkt med en annan fluorokrom. Igenkännings- och målprocessen kan ske så tidigt som 30 min postinjection av de testade nanopartiklarna. Hela försöket kräver endast avel av några par vuxna fiskar och tar mindre än 4 dagar att slutföra. Dessutom zebrafisk embryon saknar en funktionell adaptiv immunsystemet, vilket möjliggör engraftment av ett brett spektrum av mänskliga cancerceller. Därför möjliggör nyttan av det protokoll som beskrivs här testning av nanopartiklar på olika typer av mänskliga cancerceller, vilket underlättar valet av optimala nanopartiklar i varje specifikt cancersammanhang för framtida tester hos däggdjur och kliniken.
Utvecklingen av nanopartiklar som kan upptäcka, rikta och förstöra cancerceller är av stort intresse för både fysiker och biomedicinska forskare. Framväxten av nanomedicin ledde till utvecklingen av flera nanopartiklar, såsom de konjugerade med inriktning ligander och / eller kemoterapeutiska läkemedel1,2,3. Nanopartiklarnas tillsatta egenskaper möjliggör deras interaktion med det biologiska systemet, och avkänning och övervakning av biologiska händelser med hög effektivitet och noggrannhet tillsammans med terapeutiska tillämpningar. Nanopartiklar av guld och järnoxid används främst i datortomografi respektive magnetisk resonanstomografi. Medan den enzymatiska verksamheten av nanopartiklar av guld och järnoxid möjliggör detektering av cancerceller genom kolorometrisk analys, är fluorescerande nanopartiklar väl lämpade för in vivo-bildframställningsapplikationer4. Bland dem är ultrabright fluorescerande nanopartiklar särskilt fördelaktigt, på grund av deras förmåga att upptäcka cancer tidigt med färre partiklar och minskad toxicitet5.
Trots dessa fördelar kräver nanopartiklar experiment med hjälp av in vivo-djurmodeller för val av lämpliga nanomaterial och optimering av syntesprocessen. Dessutom, precis som droger, nanopartiklar lita på djurmodeller för prekliniska tester för att avgöra deras effekt och toxicitet. Den mest använda prekliniska modellen är musen, som är ett däggdjur vars underhåll kommer till en relativt hög kostnad. För cancerstudier används antingen genetiskt modifierade möss eller xenografted möss vanligtvis6,7. Längden på dessa experiment sträcker sig ofta från veckor till månader. I synnerhet för cancer metastasering studier, cancerceller direkt injiceras i cirkulationssystemet av mössen på platser som svans vener och mjälte8,9,10. Dessa modeller representerar bara slutet stadier av metastasering när tumörceller extravasera och kolonisera avlägsna organ. Dessutom, på grund av synlighet frågor, Det är särskilt utmanande att övervaka tumörcell migration och nanopartikel inriktning av tumörceller hos möss.
Den zebrafisk (Danio rerio) har blivit ett kraftfullt ryggradsdjur system för cancerforskning på grund av dess höga fruktbarhet, låg kostnad, snabb utveckling, optisk öppenhet, och genetiska bevaranden11,12. En annan fördel med zebrafisken över musmodellen är befruktningen av fiskäggen ex utero, vilket gör att embryona kan övervakas under hela sin utveckling. Embryonal utveckling är snabb i zebrafisk, och inom 24 timmar postfertilization (hpf), ryggradsdjur kropp planet har redan bildat13. Med 72 hpf kläcks ägg från chorion, övergång från embryonala till yngel scenen. Transparensen i zebrafisken, Casper stammen i synnerhet 14, ger en unik möjlighet att visualisera migration av cancerceller och deras erkännande och inriktning av nanopartiklar i ett levande djur. Slutligen, zebrafisk utveckla sina medfödda immunförsvar med 48 hpf, med adaptiva immunsystemet släpar efter och bara blir funktionella på 28 dagar postfertilization15. Denna tidslucka är idealisk för transplantation av olika typer av mänskliga cancerceller till zebrafisk embryon utan att uppleva immun avstötningar.
Beskrivs här är en metod som drar nytta av transparens och snabb utveckling av zebrafisk att visa erkännande och inriktning av mänskliga cancerceller genom fluorescerande nanopartiklar in vivo. I denna analys, mänskliga livmoderhalscancer celler (HeLa celler) genetiskt konstruerad för att uttrycka en röd fluorescerande protein injicerades i det vaskulariserade området i perivitelline hålighet 48 hpf embryon. Efter 20-24 h hade HeLa-celler redan spridit sig över embryona genom fiskcirkulationssystemet. Embryon med skenbar metastasering var microinjected med ~ 0,5 nL av en nanopartikel lösning direkt bakom ögat, där den rika kapillär säng är belägen. Med hjälp av denna teknik kan de ultrabright fluorescerande kiseldioxidnanopartiklarna rikta in sig på HeLa-celler så snabbt som 20-30 min postinjektion. På grund av sin enkelhet och effektivitet representerar zebrafisken en robust in vivo-modell för att testa en mängd olika nanopartiklar för deras förmåga att rikta specifika cancerceller.
Det protokoll som beskrivs här använder zebrafisken som ett in vivo-system för att testa nanopartiklarnas förmåga att känna igen och rikta metastaserande mänskliga cancerceller. Flera faktorer kan påverka det framgångsrika utförandet av experimenten. För det första måste embryon vara fullt utvecklade vid 48 hpf. Embryonas korrekta utvecklingsstadium gör det möjligt för dem att uthärda och överleva transplantationen av mänskliga cancerceller. Embryon yngre än 48 hpf har en betydligt lägre överlevnad …
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Ms Kaylee Smith, Ms Lauren Kwok, och Mr Alexander Floru för korrekturläsning av manuskriptet. H.F. erkänner bidragsstöd från NIH (CA134743 och CA215059), American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) och St Baldrick’s Foundation. F.J.F.L. erkänner ett stipendium från Boston University Innovation Center-BUnano tvärvetenskaplig utbildning i nanoteknik för cancer (XTNC). I.S erkänner NSF-stöd (grant CBET 1605405) och NIH R41AI142890.
Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |